Биологический материал может храниться при сверхнизкой температуре –196 °С длительное время, не теряя своей жизнеспособности, поскольку при этой температуре метаболические процессы практически остановлены. Это теоретическое положение подтверждается на практике получением потомства из замороженных эмбрионов, находившихся в криобанке несколько десятков лет. Криобиология играет важную роль в сохранении генетических ресурсов различных животных, однако современное понимание криоконсервации основано на длительной истории экспериментальных исследований в физике, химии и биологии.
На сегодняшний день существует два основных способа замораживания биологических образцов: программное замораживание и витрификация. Первый способ заключается в охлаждении с относительно небольшими скоростями, по специальной программе, состоящей из нескольких стадий. Основываясь на всестороннем исследовании процессов, происходящих при постепенном снижении температуры, современные программы замораживания эмбрионов предусматривают этап постепенного снижения температуры (0.3-2 °С в минуту). Под витрификацией же обычно понимают процесс сверхбыстрого охлаждения, когда кристаллов льда вообще не образуется. Витрификация относится к неравновесному процессу. В этом случае существует этап относительно быстрого (в идеальном случае – практически мнгновенного) охлаждения, при котором нарушается равновесие фаз, а кристаллического льда не образуется вообще. Происходит образование аморфной твердой фазы – процесс известный под названием “стеклование”. Следует отметить, что некоторые из разновидностей программного замораживания также относятся к неравновесному способу – а именно, в тех случаях, когда медленное охлаждение обрывается при температурах от –35 °С до –45 °С быстрым погружением замораживаемого материала в жидкий азот. При этом равновесие нарушается образованием внутриклеточного льда, но кристаллики настолько малы, что не могут существенно повредить клетки.
Ключевое место, как при равновесном, так и при неравновесном способе занимают криопротекторы. Традиционно криопротекторы делят на проникающие и не проникающие. Наиболее известными и широко применяемыми криопротекторами относящимися к первой группе являются диметилсульфоксид (ДМСО); многоатомные спирты, такие как глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль; одноатомный спирт метанол. Ко второй группе криопротекторов относятся, главным образом, различные олиго-, моно- и полисахариды: сахароза, трегалоза, фикол, рафиноза, фруктоза и другие сахара. Следует отметить, что эта распространенная классификация является неким обобщением, и способность проникать в клетки может достаточно сильно различаться у криопротекторов в пределах одной группы. Так, например, глицерин, как правило, проникает через клеточные мембраны намного медленнее, чем ДМСО или этиленгликоль. Более того, скорость проникновения через клеточные мембраны для того или иного криопротектора, как и их токсические эффекты, зависят от температуры и типа клеток, в частности, от стадии развития эмбриона.
Список криопротекторов непрерывно растет. Некоторые природные комплексные соединения, такие как яичный желток, некоторые пектиновые полисахариды, которые выделяют из растений, гликопротеины, выделяемые из некоторых рыб и насекомых, обладают криопротективными свойствами и их иногда используют для замораживания и криоконсервации различных биологических объектов. Как правило, комбинация криопротекторов более эффективно предохраняет замораживаемые объекты от повреждающих факторов, чем эти компоненты по отдельности, при определенных комбинациях криопротекторов наблюдается эффект синергизма. Концентрация криопротекторов при программном замораживании составляет обычно для проникающих криопротекторов около 10 %, а для не проникающих она существенно меньше. При витрификации концентрация криопротекторов как правило выше – около 40 %.
Теоретической основой для создания программ замораживания были разработки Питера Мэйзура, который является автором “двухфакторной гипотезы” повреждений, возникающих при глубоком охлаждении различных биологических объектов. По мере охлаждения препарата происходит увеличение концентрации окружающего клетку раствора, что в свою очередь, приводит к постепенному обезвоживанию клетки. Скорость обезвоживания зависит от объема клетки, а также от проницаемости её клеточной мембраны для воды. Двухфакторная гипотеза предполагает два принципиально разных механизма повреждения клетки, реализация которых зависит от скорости охлаждения препарата. В случае слишком быстрого охлаждения клетка не успевает достигнуть достаточной степени обезвоживания и в результате лишняя вода превращается во внутриклеточный лёд. Образование льда в клетке способно привести к механическим повреждениям, таким как разрыв клеточной мембраны. С другой стороны, если проводить охлаждение слишком медленно, то из-за чрезмерного обезвоживания и длительной экспозиции в высококонцентрированном растворе может произойти интоксикация клетки.
Эксперименты по замораживанию разных биологических объектов подтвердили основные положения двухфакторной гипотезы П. Мэйзура. Из двухфакторной гипотезы следует, что существует некоторая скорость охлаждения, оптимальная с точки зрения выживания клеток. Эта скорость может сильно различаться в зависимости от замораживаемого объекта. Так, например, для дрожжевых клеток оптимальная скорость охлаждения составляет 7 °С/мин, для ооцитов и эмбрионов млекопитающих – не более 1 °С/мин, а для эритроцитов человека она оценивается в 3000 °С/мин.
В процессе медленного (равновесного) программного замораживания внутриклеточная вода выходит из клеток и замещается раствором криопротектора, что существенно снижает точку кристаллизации и позволяет вне- и внутриклеточной жидкости находиться в переохлажденном состоянии. При программном замораживании эмбрионов млекопитающих, на первом этапе температуру, как правило, снижают на 1-2 °С в минуту до –7 °С - –12 °С, в зависимости от вида животных и типа криопротектора. По достижении данной температуры, образец выдерживается 5-10 минут. В этот промежуток времени, в условиях термостатирования, индуцируется кристаллизация льда внутри контейнера, содержащего замораживаемый образец – сидинг (англ. seeding). На практике, чаще всего, касаются охлажденным предметом контейнера, в котором располагается образец, искусственно создавая центры кристаллизации льда. Вода, содержащаяся в растворе криопротектора окружающего замораживаемые объекты, начинает превращаться в лёд, что приводит к выходу воды из клеток биологического образца.
После сидинга наступает второй этап: более медленное охлаждение замораживаемого объекта. Чаше всего на этом этапе температура снижается на 0.3-0.5 °С в минуту, однако, в некоторых случаях, оптимальная скорость охлаждения выше; это существенным образом зависит от вида охлаждаемого объекта, в частности от проницаемости клеточных мембран. Экспериментально показано, что образование кристаллов льда инициируется и нарастает сначала во внеклеточном пространстве. С понижением температуры вода в окружающем замораживаемый образец растворе все больше начинает переходить в лёд, а клетки охлаждаемого образца все более обезвоживаются, и происходит существенное повышение концентрации криопротектора в том растворе, который все еще остается в жидкой фазе. В этом концентрированном растворе начинает образовываться аморфная фаза. Кристаллы льда внутри клеток, как показали эксперименты, образуются при существенно более низких температурах, чем вне клеток.
Большинство классических исследований по замораживанию эмбрионов разных видов млекопитающих ориентированы на так называемом “стандартном протоколе”, при котором plunging (ангоязычный термин обозначающий быстрое завершение медленного охлаждения погружением контейнера с биоматериалом в жидкий азот) производят при темературах (–30 °С - –40 °С). При его применении с использованием криопротекторов в концентрациях 1-2 моль внутриклеточные кристаллы льда образуются, но они настолько малы, что не могут существенно повредить клетки. Этот протокол, предложенный впервые Вилладсеном рекомендован для создания криобанка лабораторных животных и до сих пор используется, например, в самом крупном мировом криоархиве мышиных линий – Джексоновской лаборатории.
Однако самое первое успешное замораживание эмбрионов производили согласно протоколу, при котором их охлаждали до гораздо более низких температур – до –80 °C или до –110 °C перед тем, как осуществить погружение биоматериала в жидкий азот. Этот классический протокол, с небольшими модификациями, до сих пор иногда применяют. При столь длительном обезвоживании кристаллов льда внутри клеток практически вообще не образуется, однако, этот классический способ программного замораживания в наши дни применяется крайне редко, так как ему присущи определенные ограничения. Прежде всего, осуществление такого длительного способа охлаждения занимает слишком много времени. Более того, столь медленное замораживание требует и очень медленного оттаивания. В конечном счете, результаты, полученные с применением более технологичного стандартного протокола ничуть не хуже по сравнению с требующим гораздо большего времени классическим вариантом.
Теоретические основы витрификации были разработаны в 1930-х годах Льюэтом и успешно реализованы по отношению к эмбрионам млекопитающих в 1980-х годах. При этом способе основным процессом является упоминавшееся выше стеклование. Переход раствора в аморфную твердую фазу происходит при высоких скоростях охлаждения – более 500 °С/мин. При проведении витрификации используют те же самые криопротекторы, что и при программном замораживании, но в концентрации от 4 до 7 моль. Данный метод эффективно применяется не только для грызунов, но и для животных, которых сложно криоконсервировать при помощи программного замораживания из-за содержания в цитоплазме их бластомеров большого количества липидных гранул.
Наряду с криопротектором, важным элементом при программном замораживании и витрификации является контейнер, в котором находится образец в процессе замораживания. Наиболее распространенными контейнерами для проведения программного замораживания и витрификации эмбрионов являются соломины, либо криопробирки.
Помимо процесса замораживания также важен и обратный процесс оттаивания. Процесс оттаивания необходимо выполнять правильно, чтобы предотвратить перекристаллизацию воды. Оттаивание также, как и замораживание бывает двух типов: медленное и быстрое. В общем, если образец был заморожен медленно, то оттаивание должно происходить медленно, при быстром же способе замораживания рекомендовано и сравнительно быстрое оттаивание. Экспериментально показано, что если биологический материал был заморожен согласно “стандартного протокола” замораживания, описанного выше, то температура оттаивания должна составлять от 300 °С до 2500 °С в минуту. При строго равновесном медленном охлаждении, оптимальная скорость оттаивания тоже очень низкая (20 °С/мин).
Разработка конкретных протоколов замораживания требует диагностики. Можно выделить два типа экспериментальных работ по исследованию процессов замораживания клеток. К первому типу относятся работы, которые заключаются в сравнении состояния клеток до и после криоконсервации. Второй тип заключается в непосредственном наблюдении процессов, протекающих при замораживании и оттаивании клеток in situ. Наиболее распространенным методом второго типа являются исследования с помощью криомикроскопа.
Криомикроскопия используется для исследования процессов протекающи при замораживании биологических объектов с середины девятнадцатого века. В самом начале микроскопические наблюдения проводились в холодных помещениях, со временем стали использоваться микроскопы, оборудованные криостатами. Криомикроскопия завоевала свою популярность среди криобиологов благодаря своей технической простоте, а также тому, что эта методика позволяет бесконтактным образом проводить наблюдения за замораживаемыми клетками in situ. Результаты криомикроскопических наблюдений легко сопоставить с оценками эффективности применяемых протоколов замораживания по жизнеспособности биологических объектов после криоконсервации.
Для получения дополнительной информации, криомикроскопию совмещают с другими методиками, например, с дифференциальной сканирующей калориметрией. С этой целью создаются даже экспериментальные установки, совмещающие два этих метода. Дифференциальная сканирующая калориметрия позволяет отслеживать количество льда в замораживаемом препарате, а также определять температуры, при которых происходят фазовые переходы.
В последнее время, стали появляться работы, в которых криомикроскопия совмещается со спектроскопией комбинационного рассеяния света; которое в англоязычной литературе часто называют Рамановской (Raman) спектроскопией (РС). Суть метода РС заключается в фокусировке монохроматического излучения на образец и исследовании спектра света, рассеянного на других длинах волн. Изменение длины волны фотона (светового кванта) происходит из-за его взаимодействия с колебаниями молекул. В результате взаимодействия фотон может (с вероятностью 10-6 ÷ 10-10) поглотить или породить квант колебания молекулы, что скажется на его энергии (и связанной с ней длиной волны). Исследуя спектр рассеянного излучения можно определить энергию колебаний, на которых происходит рассеяние света. Поскольку каждое соединение обладает индивидуальным набором колебаний, то и спектр рассеянного этим веществом света будет также индивидуален. Кроме того, РС оказывается чувствительной к различным факторам, таким как агрегатное состояние вещества.
Микроскопный объектив позволяет фокусировать излучение в малые объемы. Поэтому совмещение РС с микроскопом позволяет исследовать состав и состояние вещества с высоким (~1 мкм) пространственным разрешением. В настоящее время уже продемонстрирована возможность детектирования внутриклеточного льда в клетках млекопитающих методом РС. Также, с помощью этой методики было исследовано распределение продуктов эвтектической кристаллизации физиологического раствора при замораживании суспензии дрожжевых клеток.
Применение криомикроскопии, совмещенной с методом РС, позволяет получать информацию не только об окружении, но и о состоянии самих клеток. Например, РС оказывается чувствительной к упорядочению липидов в мембранах клетки и липидных каплях. В спектре замороженного эмбриона мыши наблюдаются острые пики на частотах 2849 и 2882 см-1 (1 см-1 равняется 30 ГГц), относящиеся колебаниям С-Н2 связи. Эти спектральные изменения связаны с упорядочением неполярных углеродных цепочек липидов при низких температурах.
Таким образом, применение РС позволяет значительно расширить экспериментальные возможности в диагностике процессов, протекающих при замораживании клеток. Криобиологические эксперименты in situ по большей части направлены на исследование механизмов криоповреждения. Как правило, условия, при которых проводятся эти эксперименты, немного отличаются от условий, в которых проводится замораживание и криоконсервация биологических объектов для реальных целей создания криобанков генетических ресурсов животных. Например, в условиях эксперимента in situ может использоваться не стандартные криопробирки или соломины, а другие криоемкости для замораживания, возможны небольшие отклонения в температурном режиме или концентрации криопротекторов. Поэтому более точную и достоверную информацию об эффективности того или иного протокола обычно получают в исследовании выживания и анализа состояния оттаянных клеток.
При наличии флуоресцентного микроскопа и витальных (пригодных для прижизненного окрашивания) флуорохромов можно достаточно быстро проверить, погиб эмбрион в процессе замораживания или выжил. Часто этот способ применяют при попытках заморозить и криоконсервировать тот или иной новый объект. Методы прижизненного окрашивания флуорохромами и последующая флуоресцентная и световая микроскопия позволяют делать выводы о сохранении жизнеспособности эмбрионов и гамет после криоконсервации. Впервые удобный и эффективный метод окрашивания эмбрионов млекопитающих витальным красителем – флюоресцеином диацетатом (FDA – fluorescein diacetate) с последующей оценкой их жизнеспособности при помощи флуоресцентной микроскопии был применен по отношению к мышиным эмбрионам австралийскими исследователями Линдой Мор и Аланом Троунсоном. Позже стали применять совместное окрашивание FDA и пропидием йодидом (PI – propidium iodide), что позволяет видеть при помощи флуоресцентного микроскопа, как живые, так и мертвые клетки.
Окрасив пережившие криоконсервацию зародыши хорька витальным флуоресцентным красителем FDA, группой Амстиславского были получены первые подтверждения того, что эмбрионы этого вида куньих успешно пережили процедуры замораживания, криохранения и оттаивания. Подобным же образом, применив несколько иные флуорохромы, удалось показать, что сперматозоиды амурского лесного кота (Prionailurus bengalensis euptilurus, Elliot, 1871), успешно пережили криоконсервацию. Окончательные выводы можно сделать, лишь убедившись в способности оттаянных объектов развиваться in vitro или in vivo. Так, например, после теста с витальным красителем, группа Амстиславского получила убедительное доказательство способности эмбрионов хорька развиваться как in vitro, так и in vivo, причем в последней работе было получено живое потомство после трансплантации эмбрионов, взятых из криобанка.