Выделяют три типа питательных сред по способу получения и составу используемых для этого компонентов: естественные, полусинтетические и синтетические. Важными свойствами любой питательной среды являются: постоянство рН (буферная емкость), осмолярность и стерильность. Для нормального развития преимплантационного эмбриона in vitro необходимо поддерживать pH в интервале от 7.2 до 7.4; содержание эндотоксинов не должно превышать нормы (не более 0.25 ЕЭ/мл); раствор должен быть изотоничным жидкости яйцевода; в нем должны отсутствовать патогены.
Естественные питательные среды готовят из продуктов природного происхождения, например, эмбрионального экстракта. Качественный и количественный состав данного типа сред может сильно варьировать, и их практически не используют для культивирования преимплантационных эмбрионов млекопитающих.
Полусинтетические питательные среды создаются на основе искусственных растворов с известным составом с добавлением естественных компонентов, например, фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Их можно рассматривать как модифицированные варианты синтетических питательных сред.
Наибольшее же распространение при культивировании эмбрионов получили синтетические питательные среды. Одной из их особенностей является точный качественный и количественный состав; они считаются “простыми”, если содержат менее 12 компонентов, и, соответственно “сложными”, если ингредиентов больше. При выборе компонентов и концентраций для их создания используются два основных подхода: “back-to-nature” и “let the embryo choose”.
При первом подходе – “back-to-nature” изучают состав среды, которая присутствует при развитии эмбриона в репродуктивных путях. Согласно этому подходу, концентрация веществ в создаваемой синтетической среде базируется на знании состава компонентов естественной среды, в которой развиваются преимплантационные эмбрионы, движущиеся от места оплодотворения (ампула яйцевода) в матку.
Второй подход – “let the embryo choose”, основан на эмпирическом подборе компонентов сред и их концентраций с последующей проверкой в тестах с культивированием эмбрионов. Создание питательной среды связано с выбором концентраций всех отдельных компонентов, поскольку эффекты каждого из них могут зависеть от концентрации других составляющих. Концентрация того или иного вещества, которая оказывает максимальный позитивный эффект на развитие эмбрионов отбирается при создании среды.
Оба подхода к созданию синтетических питательных сред имеют свои ограничения. Подход “back-to-nature” ограничивается трудностью определения концентрации веществ в естественной среде развития преимплантационного эмбриона, а подход “let the embryo choose” определяет концентрацию конечного множества компонентов, которая приводит к максимальной реакции, но при этом сложно учесть эффекты взаимодействия между различными соединениями. Большинство питательных сред для культивирования эмбрионов создают на основе сбалансированных солевых растворов с оптимальной буферной емкостью. Самыми распространенными из них являются: раствор Эрла, Кребса-Рингера, Хенкса и Тироде – сложные физиологические растворы, представляющего собой смесь неорганических солей (NaCl, KCI, СаСI2, Na2HP04 и другие) растворенных в воде, с добавлением глюкозы в качестве энергетического субстрата. Данные растворы незначительно отличаются друг от друга по качественному и количественному химическому составу.
Раствор Эрла (г/л): NaCl – 6.8; глюкоза – 1.0; KCI – 0.4; СаСI2 – 0.2; Na2HP04 – 0.125; MgS04·7H20 – 0.1.
Раствор Кребса-Рингера (г/л): NaCl – 6.92; глюкоза – 1.0; KCl – 0.35; MgSO4·7H2O – 0.29; CaCl2 – 0.28; KH2PO4 – 0.16; NaHCO3 – 0.1.
Раствора Хенкса (г/л): NaCl – 8.0; глюкоза – 1.0; KCI – 0.4; СаСI2 – 0.14; MgS04·7H20 – 0.1; MgCl·6H20 – 0.1; Na2HP04 – 0.06; KH2P04 – 0.06.
Раствор Тироде (г/л): NaCl – 8.0; глюкоза – 1.0; KCI – 0.2; СаСI2 – 0.2; MgCI·6H20– 0.1; NaHCO3 – 0.1; Na2HP04 – 0.05.
Общим для всех этих растворов является обязательное присутствие: NaCl (6.8-8.0 г/л), глюкозы (1.0 г/л), KCl (0.2-0.4 г/л), СаСI2 (0.14-0.2 г/л). По остальным компонентам наблюдается ряд отличий: MgS04·7H20 (0.1-0.29 г/л) (отсутствует в растворе Тироде), Na2HP04 (0.05-0.125 г/л) (отсутствует в растворе Кребса-Рингера), KH2P04 (0.06-0.16 г/л) (отсутствует в растворе Эрла), MgCl·6H20 (0.1 г/л) (содержится в растворе Хенкса и Тироде), NaHCO3 (0.1 г/л) (содержится в растворе Кребса-Рингера и Тироде).
К примеру, для культивирования эмбрионов часто применяют среду 199, которая была создана еще в 1950-ом году. Данная среда имеет очень сложный состав, который многократно корректировался. Она создана на основе раствора Хенкса, и успешно используется для культивирования эмбрионов на этапе развития преимплантационного эмбриона с 8 клеток до бластоцисты.
В состав современной среды 199 входят следующие компоненты (мг/л):
1) неорганические соли (NaCl – 8000.0; KCl – 400.0; MgS04·7H20 – 200.0; CaCl2·2Н2О – 185.5; KH2P04 – 60.0; Na2HPO4 – 47.5; Fe(NO3)3·9Н2О – 0.01);
2) углеводы (глюкоза – 1000.0; рибоза – 0.5);
3) аминокислоты (глютамин – 100.0; аргинина хлорид – 70.0; лизина хлорид – 70.0; глютаминовая кислота – 66.82; лейцин – 60.0; глицин – 50.0; тирозина двунатриевая соль – 49.72; пролин – 40.0; аспарагиновая кислота – 30.0; треонин – 30.0; аланин – 25.0; валин – 25.0; серин – 25.0; фенилаланин – 25.0; гистидина хлорид одноводный – 21.88; изолейцин – 20.0; метионин – 15.0; гидрооксипролин – 10.0; триптофан – 10.0; цистеина хлорид – 0.0987);
4) эмульгатор и модификатор вязкости: твин – 80.0;
5) органические соли (натрия ацетат – 36.71; натриевая соль фенола красного – 17.0; менафтона натрия бисульфат трехводный – 0.019; кальция пантотенат – 0.01);
6) нуклеотиды (аденина сульфат – 10.0; АТФ двунатриевая соль – 10.0; 2-дезоксирибоза – 0.5; гуанина хлорид – 0.3; тимин – 0.3; урацил – 0.3; 5-АМФ – 0.2); липотропные вещества (холина хлорид – 0.5; холестерол – 0.2);
7) витамины (ретинол-ацетат – 0.1147; кальциферол – 0.1; аскорбиновая кислота – 0.05; пара-аминобензойная кислота – 0.05; никотинамид – 0.025; пиридоксальхлорид – 0.025; пиридоксинхлорид – 0.025; никотиновая кислота – 0.025; биотин – 0.01; рибофлавин – 0.01; тиамина хлорид – 0.01; токоферола фосфата двунатриевая соль – 0.01; фолиевая кислота – 0.01);
8) производные пуринов (ксантин – 0.3; гипоксантин – 0.3);
9) витаминоподобное вещество: инозитол – 0.05;
10) антиоксидант: глютатион – 0.05.
К синтетическим питательным средам, предназначенным для культивирования преимплантационных эмбрионов млекопитающих, относят: M-16, KSOM, R1ECM, HECM, среду 199 и многие другие. Одной из первых и наиболее сложных сред, применявшихся для культивирования эмбрионов различных видов животных, является среда 199. Для улучшения состава среды, в качестве стимулирующего развитие эмбрионов фактора в нее могут добавлять 5-15 % сыворотки крови коровы и других млекопитающих. В качестве источника аминокислот иногда используют бычий сывороточный альбумин, хотя в некоторые среды добавляют свободные аминокислоты, которые являются необходимым субстратом, как для пластического, так и для энергетического обмена.
В процессе катаболизма эмбрион перерабатывает аминокислоты с образованием аммония, который обладает высокой эмбриотоксичностью. Существует два способа решения данной проблемы. Во-первых, можно перенести эмбрионы в каплю свежей питательной среды, а во-вторых, удалить вредный побочный продукт при помощи специально разработанного метода с использованием фермента глутаматдегидрогеназы, который осуществляет трансаминирование α-кетоглутарата, присоединяя к нему свободный аммоний, образуя в качестве продукта безвредный для клеток глутамат.
Выбор среды зависит как от видовой принадлежности, так и от стадии развития преимплантационного эмбриона. У большинства видов млекопитающих зародыши на стадии морулы переходят из яйцевода в матку, где среда несколько отличается по своему составу. В силу того, что состав среды в яйцеводах и матке различен, зачастую, для ранних стадий развития эмбрионов используют один состав среды, а для более поздних, начиная с морулы и до поздней бластоцисты – другой состав (sequential media).
Добавление стимулирующих факторов может различным образом влиять на культивируемые зародыши в зависимости от стадии развития, на которой они находятся. Например, добавление фетальной сыворотки коровы стимулирует развитие зародышей крысы на стадии формирования бластоцисты, но угнетает развитие эмбрионов этого вида на более ранних этапах. Показано, что среды, которые содержат в своем составе свободные аминокислоты, благотворно влияют на процесс образования бластоцист. Они более предпочтительны при культивировании поздних стадий преимплантационных эмбрионов по сравнению с теми, которые имеют в своем составе альбумины (например, бычий сывороточный альбумин).
Согласно подходу “back-to-nature”, в среде должны содержаться питательные вещества, которые участвуют в процессах метаболизма (пластического и энергетического обмена). Энергетическим субстратом для эмбриона в матке является глюкоза, хотя в питательные среды можно добавлять и другие компоненты в качестве источников энергии (пируват, фруктозу, галактозу). В процессе метаболизма эмбрион перерабатывает глюкозу с образованием в качестве побочного продукта лактата, увеличение концентрации которого в среде подавляет энергетический обмен. Зародыши млекопитающих при культивировании in vitro образуют большее количество лактата, чем в условиях in vivo, что приводит к увеличению его концентрации в капле питательной среды и тормозит их развитие. Это обстоятельство, наряду с тем, что разные стадии преимплантационного зародыша отличаются разными требованиями к среде, является одной из причин того, что при длительном культивировании производят замену среды более свежей.
В синтетические питательные среды иногда добавляют некоторые вспомогательные вещества: феноловый красный в качестве индикатора pH, антибиотики с целью предотвращения бактериального заражения и другие. В качестве антибиотиков обычно используют пенициллин и/или стрептомицин, а также в некоторых случаях микостатин (против заражения спорами дрожжевых грибов рода Candida). Показано, однако, что пенициллин и его производные угнетают развитие эмбрионов некоторых видов млекопитающих; в этих случаях применяют другие антибиотики.
Витамины являются кофакторами многих ферментативных процессов, протекающих в быстро делящихся клетках преимплантационного эмбриона. Добавление их в питательную среду улучшает и стабилизирует метаболизм в бластомерах и способствует развитию зародыша.
Нуклеотиды необходимы для синтеза нуклеиновых кислот и особенно активно они потребляются, начиная со стадии морулы, когда происходит наиболее интенсивное деление клеток эмбриона.
Антиоксиданты, например, глютатион, защищают клетки эмбриона от вредоносного воздействия образующихся в ходе метаболизма свободных радикалов (супероксидного аниона, перекиси водорода и других).
Прозрачная оболочка (zona pellucida)выполняет важнейшую барьерную и структурную функцию во время преимплантационного развития млекопитающих. В питательную среду, в некоторых случаях, добавляют эмульгаторы и осмолиты, например: поливиниловый спирт, твин, таурин и другие. Эти вещества способны поддерживать клеточный гомеостаз за счет регуляции поступления воды через оболочку эмбриона и цитоплазматическую мембрану отдельных бластомеров, а также препятствовать нарушению структуры zona pellucida.
Преимплантационные эмбрионы мышей и других видов млекопитающих развиваются в атмосфере, состоящей из 95 % воздуха и 5 % углекислого газа. Это стандартные условия культивирования in vitro. Энергетический обмен в клетках преимплантационного эмбриона идет по пути гликолиза, то есть без участия кислорода, а присутствие в среде последнего оказывает угнетающее действие на клетки зародыша и тормозит его развитие. Более того, образование свободных радикалов зависит от содержания кислорода в атмосфере закрытого сосуда, в котором происходит культивирование, что оказывает большое влияние на развивающиеся эмбрионы. При культивировании преимлантационных эмбрионов некоторых видов млекопитающих и человека иногда используют мультигазовые смеси, регулируя содержание в ней не только углекислого газа, но и кислорода, причем показано, что снижение содержания кислорода способствует лучшему развитию зародышей.