Начало донорства яйцеклеток датируется 1983 годом, когда его впервые использовали для лечения случая первичной недостаточности яичников (Trounson et al., 1983). ЭКО с донорскими яйцеклетками— это комплексная стратегия, обычно используемая для лечения женщин, которые не могут забеременеть с помощью собственных яйцеклеток. С момента своего появления использование донорских ооцитов становится все более распространенным, особенно в позднем репродуктивном возрасте, повторных неудачах ЭКО и риске передачи генетического заболевания.
Донорство ооцитов состоит из следующего: сбор ооцитов от донора, прошедшего стимуляцию яичников; оплодотворение ооцитов сперматозоидами партнера реципиента; культивирование клеток in vitro; и последующий перенос эмбриона в матку реципиента.
В Европе отбор доноров основывается на определенных критериях:
- возраст донора должен быть моложе 35 лет;
- донор должен быть здоров;
- пройти обследование на венерические заболевания;
- иметь хороший овариальный резерв;
- и иметь нормальный кариотип.
Подбор доноров основан на фенотипических признаках (цвет волос, глаз и кожи) и группе крови. В Европе чаще всего работают с витрифицированными ооцитами - практика, которой способствуют банки донорских яйцеклеток, особенно в таких странах, как Италия, где донорство свежих ооцитов теоретически возможно, но практически невозможно: причиной этого является отсутствие доноров, поскольку итальянское законодательство не разрешает возмещение. Поэтому итальянские центры ЭКО наладили сотрудничество с международными банками криоконсервации ооцитов, чтобы удовлетворить огромный спрос на лечение донорскими ооцитами.
Итальянские центры ЭКО используют различные стратегии, позволяющие им использовать ооциты из иностранных банков. Самый популярный рабочий процесс включает в себя импорт витрифицированных донорских ооцитов из зарубежных банков и проведение интрацитоплазматической инъекции спермы (ИКСИ) с использованием свежей спермы партнера реципиента.
Недавние данные поставили под сомнение общую эффективность такого подхода. Это связано с тем, что пагубные эффекты, возникающие в результате витрификации и разморозки ооцитов, могут уменьшить количество яйцеклеток, доступных для оплодотворения, с последующим снижением достижимого уровня живорождения за цикл.
В 2019 году Ла Марка и соавт. (2019) предложили стратегию, основанную на использовании криоконсервированных эмбрионов вместо криоконсервированных ооцитов, чтобы удовлетворить растущий спрос на донорство ооцитов. Этот подход основан на отправке замороженных сперматозоидов из страны реципиента в страну донора ооцитов. Здесь размороженные сперматозоиды используются для оплодотворения свежих донорских ооцитов, а полученные эмбрионы затем криоконсервируются и транспортируются в направляющий центр ЭКО. Это исследование пришло к выводу, что коэффициент живорождения (LBR) был более чем приемлемым и выше, чем у витрифицированных ооцитов. Недавний ретроспективный анализ донорских программ США за 2013–2015 гг. , включивший 30 160 циклов ЭКО со свежими или криоконсервированными донорскими ооцитами, показал, что свежие донорские ооциты давали значительно более высокую частоту живорождения на каждый начатый цикл, чем криоконсервированные донорские ооциты (51,1 против 39,7%); однако анализ критических параметров для успешных циклов не проводился, особенно с использованием витрифицированных ооцитов (Kushnir et al., 2018). Недавно Риенци и другие (2020) попытались определить правильную клиническую стратегию для повышения эффективности циклов донорства яйцеклеток с использованием витрифицированных ооцитов. Они пришли к выводу, что количество взятых ооцитов (от восьми до девяти ооцитов) и перенос на стадии бластоцисты являются наиболее важными факторами.
Авторы исследования, опубликованного в RBMO, попытались ответить на вопрос: Какие факторы влияют на успех программ донорства с витрифицированными ооцитами?
Они провели обсервационное когортное исследование 431 цикла донорства ооцитов ( в период с января 2015 г. по февраль 2019 г.). В общей сложности 398 пар прошли цикл ЭКО с донорскими витрифицированными яйцеклетками. Были включены все последовательные циклы донорства ооцитов, проведенные в Центре репродуктивной медицины Европейской больницы в Риме, Италия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Это обсервационное когортное исследование проводилось в период с января 2015 г. по февраль 2019 г. Все последовательные циклы донорства ооцитов, проведенные в Центре репродуктивной медицины Европейской больницы в Риме,Италия, были включены. Все данные о пациентах, циклах и результатах были зарегистрированы в базе данных и проанализированы ретроспективно. Витрифицированные ооциты были отправлены из испанского банка (Ceifer Bank, Севилья, Испания) в Италию в сухом транспортном средстве с азотом в паровой фазе специализированным курьером. Температуру постоянно контролировали электронным детектором. Доноры ооцитов соответствовали критериям отбора, изложенным в итальянских и европейских правилах, и подбирались бесплодным парам.
Эмбриологический этап
Разморозку ооцитов проводили по протоколу Kuwayama (Kuwayama, 2007) с использованием набора для разморозки (Kitazato Vitrification Kit) (BioPharma, Shizouka, Japan). Вкратце, Cryotop быстро извлекали из жидкого азота и сразу погружали в согревающий раствор на 60 с при 37°C. Затем ооциты переносили в раствор для разведения на 3 мин при комнатной температуре, а затем два этапа в промывочный раствор по 5 мин каждый. Наконец, ооциты помещали в 50-мкл капли питательной среды (G1 Plus) (Vitrolife, Frölunda, Швеция) под маслом и выдерживали при 37°C, 5% O2, 6% CO2. После сбора спермы, полученной путем эякуляции, оценивали параметры спермы (объем, концентрацию сперматозоидов, нормальную морфологию и подвижность). Свежая сперма использовалась в 410 случаях, замороженная сперма — в 11 случаях и замороженные сперматозоиды, извлеченные хирургическим путем, — в 10 случаях. Ооциты оплодотворяли методом ИКСИ через 1 ч после разморозки полученными подвижными сперматозоидами. Интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов проводили при 37°С в 10 мкл буферной среды (G-Mops Plus) (Vitrolife, Frölunda, Швеция) под маслом. После оплодотворения ооциты культивировали при 37°C, 5% O2, 6% CO2 в инкубаторе покадровой съемки (EmbryoScope) (Unisense FertiliTech, Орхус, Дания). Все культуры проводили под маслом в последовательных средах (G1 Plus и G2 Plus, Vitrolife, Швеция) со сменой среды на 3-й день в случае культивирования на стадии бластоцисты.
Оставшиеся после переноса эмбрионы отбирали для криоконсервации в соответствии с критериями, описанными Rienzi et al. (2018) и они криоконсервированы путем витрификации с использованием протокола Kuwayama (Kuwayama et al., 2007) с использованием набора для витрификации и криотопов (Kitazato Vitrification Kit) (BioPharma, Shizouka, Japan). Вкратце, эмбрионы инкубировали в уравновешивающем растворе в течение 15 мин, а затем перемещали в раствор для витрификации на 30–60 с при комнатной температуре. Наконец, эмбрионы загружали на Cryotops в небольшом объеме (<0,1 мкл) и быстро погружали в жидкий азот.
Перенос эмбрионов
Эмбрионы или бластоцисты были отобраны для переноса путем морфологической оценки. Перенос одного или двух эмбрионов под ультразвуковым контролем осуществлялся либо на стадии дробления, либо на стадии бластоцисты катетером K-SOFT5000 (Cook Medical, Брисбен, Австралия) или Wallace PEB623 SURE PRO ULTRA (Smiths Medical International Ltd., Великобритания).
Перенос эмбрионов осуществлялся на фоне заместительной гормональной терапии: всем пациенткам назначали агонист гонадотропин-высвобождающей гормональной терапии (Декапептил 3,75мг) (Ipsen, Pharma Biotech, Signes, Франция) на 21-й день цикла для временного подавления функции яичников и препарат для роста эндометрия 4 мг эстрадиола валерата перорально 2 раза в день (Прогинова) (Байер, Берлин, Германия) начали с 3-го дня цикла в течение 5 дней, затем по 6 мг каждый день. Когда толщина эндометрия достигала не менее 7-8 мм и внешний вид был трехслойным, ооциты размораживали и сдавался эякулят/размораживали сперматозоиды. В тот же день реципиенты начинали внутримышечное введение прогестерона (Пронтогест 50 мг) (IBSA, Лоди, Италия) для поддержки лютеиновой фазы до 10-й недели беременности в случае беременности. Осуществлялся перенос эмбрионов после 4 или 6 дней приема прогестерона в зависимости от того, происходил ли перенос эмбриона на стадии дробления или бластоцисты. Уровень бета-ХГЧ измеряли через 14 или 11 дней, в зависимости от стадии развития переносимого(ых) эмбриона(ов).
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
В общей сложности 398 пар прошли 431 цикл ЭКО (средний возраст женщин: 43,2 ± 3,5 года, 28–50 лет; средний возраст мужчин: 44,7 ± 6,1 года, 28–73 года) с импортированными донорскими витрифицированными ооцитами (средний возраст донора: 25,2 ± 3,5 года, 19–34 года). Данные представлены по 431 циклу, так как пациенты проявляли разные характеристики на разных циклах. В общей сложности 365 пар прошли один цикл и 33 пары прошли два цикла за рассматриваемый период. Один и тот же донор использовался для пар, прошедших два цикла.
Характеристики пациентов и доноров представлены в ТАБЛИЦЕ 1
Также представлена классификация ИМТ по классам для пары-реципиента и донора в ТАБЛИЦЕ 2.
Ооциты и эмбриологические данные за весь период исследования представлены в ТАБЛИЦЕ 3: каждой паре было выделено в среднем 7,6 ооцитов (минимум: 3; максимум 12).
Выживаемость после разморозки была хорошей (88,2 ± 14,7), и у всех пациенток было не менее двух ооцитов для оплодотворения. Перенос эмбрионов отменили только в пяти из 431 цикла из-за отсутствия ооцитов (n = 3), остановки деления эмбриона (n = 1) и дегенерации эмбриона (n = 1); в 25 из 431 цикла перенос свежих эмбрионов не проводился по клиническим показаниям. Скорость формирования эмбрионов составила 49,72 % ± 22,22 (табл. 3). Перенос свежих эмбрионов осуществлялся в 401 цикле с одним или двумя эмбрионами на перенос (в среднем 1,7 ± 0,5), за 72 цикла переноса эмбрионов был проведен на 5-е сутки (17,96%) и у 66 из 72 (91,7%) была получена хотя бы одна бластоциста для витрификации; в 313 циклах (78,05%) перенос эмбрионов был проведен на 3-й день и в 16 циклах (3,99%) на 2-й день (ТАБЛИЦА 3).
Среди циклов с переносом эмбрионов на 2-й или 3-й день в 95 (28,9%) не удалось получить эмбрион, пригодный для витрификации.
В целом частота положительных результатов теста на беременность на один цикл переноса свежих эмбрионов составила 63,3% (n = 254/401), клиническая беременность наступила в 51,8% циклов (n = 202/390; данные доступны для 390 циклов), частота живорождение за цикл (364 - количество циклов с доступными данными о результатах) составила 39,0% (n = 142/364; 122 [33,52%] одним плодом, 19 [5,22%] двойней и одна тройня (ТАБЛИЦА 4) и частота родов живыми на клиническую беременность составила 70,3% (142/202).
Общее количество живорожденных детей составило 153 (ТАБЛИЦА 9): 122 от одноплодных, 30 от двойни (22 двойни и восемь родов от многоплодной беременности, закончившейся одноплодной беременностью) и один живорожденный от тройни.
Анализ демографических характеристик пары и донора показал, что только мужской ИМТ значительно отличался по результатам теста на бета-ХГЧ (ТАБЛИЦА 5).
Индекс массы тела был разделен на четыре класса: нормальный вес (от 18,5 до <25 кг/м2), недостаточный вес (<18,5 кг/м2), избыточный вес (от 25 до <30 кг/м2) и ожирение (≥30 кг/м2). В 49% неудачных циклов мужчины имели избыточный вес, по сравнению с 39,4% в циклах с положительным тестом на бета-ХГЧ (P = 0,033). Кроме того, доля мужчин с избыточным весом или ожирением была значительно выше в циклах с отрицательным бета-ХГЧ по сравнению с теми, у кого был положительный тест на бета-ХГЧ (60,5% против 49,2%, P = 0,03) Связь между ИМТ женщины или донора и результатами теста на бета-ХГЧ, однако, не было статистически значимым. На основе однофакторного анализа (ТАБЛИЦА 5 и ТАБЛИЦА 6) была построена многомерная логистическая модель с учетом переменных P< 0,10.
Поэтому в модель были включены мужской ИМТ (или избыточный вес/ожирение), два пронуклеуса (2PN), скорость формирования эмбриона и день переноса. В многофакторном анализе ИМТ все еще был значительным (ТАБЛИЦА 7). В частности, пары, в которых мужчины имели избыточный вес, имеют скорректированную вероятность (с поправкой на 2PN, скорость формирования эмбриона и день переноса) иметь положительный бета-ХГЧ ниже, чем у людей с нормальным весом (ОШ 0,63; ДИ от 0,41 до 0,96; Р = 0,032) (ТАБЛИЦА 7).
По мере увеличения числа 2PN вероятность положительного теста на бета-ХГЧ значительно возрастает на 17% (ОШ 1,17; ДИ от 1,01 до 1,36; Р = 0,035). Перенос эмбрионов на 2-й день по сравнению с 5м днем значительно снижает вероятность клинической беременности (ОШ 0,23, ДИ от 0,07 до 0,77; P = 0,018) (ТАБЛИЦА 8). Частота клинической беременности при переносе эмбрионов на дни 2, 3 и 5 составили 25% (4/16), 51,4% (158/307) и 59,7% (40/67) соответственно.
Взаимосвязь между классами мужского ИМТ и коэффициентом живорождения также изучалась с помощью логистической регрессии; не было обнаружено статистически значимых различий в коэффициенте рождаемости между мужчинами с нормальной массой тела и ИМТ 25 кг/м2 и выше (ОШ 0,71; интервал прогноза = 0,46–1,08; Р = 0,107).
За период исследования было разморожено 3275 ооцитов и родилось 153 ребенка (ТАБЛИЦА 9).
Эти цифры соответствуют 4,7%-ному количеству размороженных ооцитов до ребенка и оценке в 21,4 ооцита, необходимых для одного ребенка. Если считать только произведенные эмбрионы, среднее число равно 3,71 эмбрионов, произведенных каждый цикл; соотношение эмбрионов к ребенку составляло 9,6%, и на одно живорождение требовалось 10,4 эмбриона. Эти расчеты проводились на количество выполненных циклов, хотя количество циклов, по которым имеются данные о коэффициентах живорождения, составляет 364. Учитывая только цикла и 2766 размороженных ооцитов, 5,5% размороженных ооцитов до ребенка и на ребенка требовалось 18,08 ооцитов; 11,3% от количества эмбрионов к ребенку и 8,8 эмбрионов, необходимых на одного ребенка.
Из 398 пациентов, перенесших 401 цикл переноса свежих эмбрионов, 155 пациентов подверглись последующему криопереносу. Частота живорождения у пациенток, перенесших криоперенос, составила 27,7% (n = 43/155). Совокупная частота живорождений на конец периода наблюдения составила 185/364 (50,8%). Дополнительный статистический анализ был проведен путем включения параметров спермы (объем, концентрация сперматозоидов, нормальная морфология и подвижность) (ТАБЛИЦА 10).
Линейная регрессия количества 2PN указывает на то, что концентрация сперматозоидов (коэффициент B: 0,011 ДИ 95% от 0,00 до 0,019; P = 0,02) нормальное значение морфологии (коэффициент B: 0,22; 95% ДИ 0,07–0,037;P = 0,005) и увеличение подвижности A + B (коэффициент B: 0,014; 95% ДИ от 0,00 до 0,025; P = 0,022), увеличивает количество 2PN. С другой стороны, класс ИМТ (нормальный вес, избыточный вес, ожирение) не влияет на количество 2PN (ТАБЛИЦА 11). Изучена взаимосвязь между мужским ИМТ и параметрами спермы: распределение концентрации различно в трех группах ИМТ (Р = 0,011); особенно мужчины с ожирением имеют значительно более низкую концентрацию, чем мужчины с нормальным весом (P = 0,006 после поправки Бонферрони) (РИСУНОК 1).
Не было обнаружено статистически значимых различий в объеме (P = 0,722), морфологии (P = 0,100) и подвижности (P = 0,179).
ОБСУЖДЕНИЕ
Витрификация — это деликатный метод, требующий точного соблюдения протокола, и он может быть неэффективным, особенно когда его проводят менее опытные команды (De Munck et al., 2017).
Анализ данных выявил хорошую выживаемость после разморозки (88,2 ± 14,7), так как достижение выживаемости более 90% считается показателем хорошего владения техникой и наличие не менее двух ооцитов для оплодотворения на одного пациента. Эти результаты соответствуют заявленным в аналогичных исследованиях (Garcia et al., 2011; Cobo et al., 2016; Rienzi et al., 2020). Недавние рандомизированные контролируемые исследования показали, что репродуктивные результаты между витрифицированными и свежими ооцитами сходны, когда методы витрификации выполняются опытными командами (Cobo et al., 2008; Rienzi et al., 2010; Cobo and Diaz, 2011; Parmegiani et al. , 2011). Недавнее исследование Корне-Бартоломе и другие. (2020 г.), в том числе 1844 цикла донорства ооцитов (37 520 ооцитов), сравнили клинические результаты использования витрифицированных и свежих донорских ооцитов. Циклы с использованием витрифицированных ооцитов приводили к более низкой частоте прогрессирующей беременности по сравнению с циклами со свежими ооцитами; однако при рассмотрении только тех циклов, в которых 100% выживаемость после разморозки произошла, частота прогрессирующей беременности между свежими и витрифицированными ооцитами была сопоставима. Корне-Бартоломе и др. (2020) пришли к выводу, что на репродуктивные результаты этих циклов влияет эффективность используемой техники разморозки, а не повреждение ооцитов из-за процесса быстрого охлаждения, которому подвергаются ооциты (Cornet-Bartolomé et al., 2020).
При анализе критических моментов программы донорства гамет с использованием витрифицированных ооцитов было сделано несколько наблюдений. Во-первых, скорость оплодотворения и 2PN значительно влияют на исход цикла: по мере увеличения количества 2PN вероятность наличия положительного бета-ХГЧ увеличивается на 17%. Сообщалось о сильной связи между частотой оплодотворения и имплантационным потенциалом эмбрионов, который обычно коррелирует с качеством ооцитов (Mitchell et al., 2010). Настоящее исследование показывает влияние мужского фактора на скорость оплодотворения витрифицированных ооцитов, поскольку количество 2PN увеличивается по мере увеличения концентрации сперматозоидов, значения нормальной морфологии и подвижности A + B. Вероятно, это означает, что витрифицированные ооциты не функционируют также как свежие в случае тяжелого мужского бесплодия. Более того, коэффициент оплодотворения сегодня считается новым показателем совокупного коэффициента живорождения (Scaravelli et al., 2021).
В настоящем исследовании возраст отца не влиял отрицательно на репродуктивные исходы. Это согласуется с предыдущими исследованиями и систематическими обзорами, которые показывают, что поздний возраст отца может не влиять на показатели беременности и живорождения в программах донорства яйцеклеток, особенно когда донор моложе 36 лет (Begueria et al., 2014; Sagi, Дайн и др., 2015). Фактически, в недавнем метаанализе, в котором изучалась взаимосвязь между возрастом отца и эмбриональной анеуплоидией, данные не показали увеличения эмбриональной анеуплоидии с возрастом отца, за исключением небольшого увеличения сегментарной анеуплоидии после 50 лет (Dviri et al., 2021). Это контрастирует с недавним парным анализом с использованием ооцитов братьев и сестер, который показал снижение частоты живорождения, частоты имплантации и увеличение частоты выкидышей, особенно если возраст отца был старше 48 лет (du Fossè et al., 2020);
Это связано с тем, что у пожилых мужчин снижается способность производить восьмиклеточные эмбрионы на 3-й день (Van Opstal et al., 2021).
Настоящее исследование демонстрирует, что мужской ИМТ оказывает негативное влияние на клинические результаты программ донорства яйцеклеток с витрифицированными ооцитами, т.е. меньшая вероятность положительного бета-ХГЧ в парах с избыточным весом партнера-мужчины, чем в парах с нормальным весом (ОШ 0,63; ДИ от 0,41 до 0,96; Р = 0,032) (табл. 7).
Насколько нам известно, влияние мужского ИМТ на программы донорства яйцеклеток с витрифицированными ооцитами еще недостаточно изучено. Опубликованные данные о влиянии мужского ИМТ на репродуктивные исходы, полученные в исследованиях гомологичных циклов ЭКО/ИКСИ, противоречивы. Систематический обзор и метаанализ, демонстрирующий связь между увеличением мужского ИМТ и значительным снижением частоты клинической беременности и живорождения (Mushtaq et al., 2018) противоречит недавней статье, в которой ожирение отца не влияет на лабораторные и клинические результаты ЭКО (Kim et al., 2021). Несколько исследований показывают, что ИМТ и качество сперматозоидов имеют обратную корреляцию. Увеличение ИМТ вызовет снижение концентрации сперматозоидов, прогрессирующей подвижности и морфологии (Kozopas, 2020). Недавнее обсервационное исследование 3966 доноров спермы подтверждает, что избыточный вес в значительной степени связан со снижением всех параметров спермы (Ma et al., 2019).
Исследование параметров спермы в соответствии с ИМТ в настоящем исследовании показало, что только концентрация сперматозоидов была значительно ниже (P = 0,006) у мужчин с ожирением по сравнению с мужчинами с нормальным весом. Несмотря на то, что наблюдалась тенденция к снижению подвижности, у пациентов с ожирением по сравнению с пациентами с нормальной массой тела существенной разницы обнаружено не было. Однако индекс массы тела не влиял на частоту оплодотворения и, следовательно, на число 2PN. Эти результаты могут быть связаны с применением методов ИКСИ, а не традиционных методов ЭКО.
В заключение, результаты данного исследования контрастируют с предыдущими исследованиями, которые не показали корреляции между ИМТ партнера-мужчины и репродуктивными результатами в программах донорства яйцеклеток (Rubio и др., 2015; Капелоуто и др., 2018). Гипотетически мужское ожирение также может влиять на качество ДНК сперматозоидов, что витрифицированные ооциты не способны это компенсировать, но проведенные прежде исследования показывают противоречивые результаты (Oliveira et al., 2018; Zhu et al., 2021). Поэтому необходимы новые исследования.
В организационном плане использование витрифицированных ооцитов имеет ряд преимуществ: во-первых, нет необходимости синхронизировать цикл донора и реципиента; кроме того, это дает возможность транспортировки витрифицированных донорских ооцитов в разные части мира и, возможно, снижает затраты на цикл лечения. Кроме того кроме количества ооцитов, доступных после разморозки, настоящее исследование показывает, что мужской ИМТ, характеристики спермы и перенос бластоцисты также являются критическими параметрами, способными влиять на результаты программ донорства яйцеклеток с витрифицированными ооцитами.