Новая статья в Biomedical Optics Express
Группа ученых их ФИЦ ХФ РАН совместно с ИБГ РАН выполнила и опубликовала работу, в которой рассказывается об оригинальной методике - фемтосекундной лазерной энуклеации ооцитов мыши. Эти результаты помогут развитию технологии клонирования – у животных и метода цитоплазматической замены – у человека.
В 1997 году мир потрясла новость о революционной научной методике – клонировании млекопитающих. Тогда появилась на свет знаменитая овечка Долли. С тех пор минуло четверть века, процедура клонирования давно уже обрела формат отработанных протоколов и прописей, и в списке клонированных млекопитающих числится больше десятка видов: мышь, овца, свинья, корова, лошадь, коза, осел, собака, кошка, макака-резус, крыса. Однако эффективность клонирования в наши дни мало отличается от первых опытов и составляет порядка 1%: если посчитать, сколько яйцеклеток реконструировали и сколько живых животных из них потом получилось.
Процесс клонирования обычно занимает несколько шагов. Главный из них – удаление из яйцеклетки ее собственной ДНК (энуклеация), в результате чего получается яйцеклетка без ДНК – реципиентный цитопласт. Затем в реципиентный цитопласт вносят ядро, содержащее ДНК того организма, который собираются клонировать, и получают реконструированный эмбрион, который затем вносят в матку животного – суррогатной матери. Между прочим, задача приготовления реципиентного цитопласта актуальна и в работе с ооцитами человека для осуществления метода цитоплазматической замены, в результате которого получаются «дети от трех родителей». В обоих случаях ДНК из яйцеклетки (ооцита) удаляют одинаково – прокалывают ооцит микроиглой и высасывают оттуда ДНК.
В работе, которую совсем недавно опубликовали ученые из ФИЦ ХФ РАН (при поддержке гранта РНФ №21-75-10155), предлагается совершенно иной подход к подготовке реципиентного цитопласта. Подход заключается в применении фемтосекундного лазерного «скальпеля» для энуклеации. Хотя в ооцитах на стадии метафазы II и нет сформированного, интерфазного ядра, термин «энуклеация» всё равно используется и означает удаление ядерной ДНК, которая на данной стадии сконцентрирована в составе метафазной пластинки. Лазерное излучение с длиной волны 795 нм, в обычных случаях никак не поглощаемое клеткой, за счет высокой интенсивности и острой фокусировки объективом с высокой числовой апертурой (NA = 0.7) в фокальной области начинает поглощаться по нелинейным механизмам, обеспечивая тем самым локальную деструкцию биоматериала. Диаметр фокальной перетяжки оценивается как 1.4 μм. Ооциты, окрашенные специальным флуоресцентным красителем для визуализации ДНК, подвергали лазерному излучению. После того, как лазером подействовали на метафазную пластинку, люминесценция исчезала. Чтобы убедиться, что люминесценция исчезает за счет разрушения ДНК, а не за счет фотообесцвечивания, была проведена повторная окраска другим, контрастным по спектру красителем – так было доказано, что лазер действительно разрушает ДНК. При этом, в отличие от традиционной методике энуклеации при помощи микроиглы, не происходит прокалывания ооцита. Вся операция происходит в микро-объеме и не приводит к разрушению цитоплазматической мембраны клетки.
После лазерной энуклеации ооциты подвергали партеногенетической активации – и они не способны были развиваться, что так же подтверждает эффективность энуклеации. С другой стороны, ооциты, которые претерпели точно такое же воздействие, только лазерное излучение направлялось «мимо» метафазной пластинки, активировались и развивались с эффективностью 90% - так же, как и ооциты контрольной группы. Это значит, что само по себе лазерное воздействие не оказывает существенного токсического действия на ооциты, а остановка в развитии происходит именно благодаря разрушению ДНК.
Ключевое преимущество лазерной энуклеации перед энуклеацией механической заключается в том, что не теряется и не выбрасывается ни единой частицы вещества, содержащегося в клетке. В случае аспирации метафазной пластинки при помощи микроиглы помимо повреждения целостности цитоплазматической мембраны происходит потеря небольшого объема цитоплазмы. Но в цитоплазме, окружающей метафазную пластинку, содержатся репрограммирующие факторы, которые запускают и поддерживают развитие яйцеклетки и эмбриона. Возможно, именно потеря репрограммирующих факторов ограничивает эффективность клонирования. Поможет ли фемтосекундная лазерная энуклеация увеличить эффективность клонирования? Нам предстоит это увидеть.