Я уже написала ранее, как лучше и быстрее выделять ДНК. Эта моя статья касается полимеразной цепной реакции. Я не буду подробно останавливаться на том, что это такое. Конечно, если вы хотите применять эти методы в лаборатории, то вам надо знать строение ДНК и как происходит ПЦР, и для этого я вас отправляю к отличной длинной статье на Биомолекуле. И в интернете очень много видео на эту тему. А лучше всего прочитать соответствующие главы в любом учебнике по молекулярной биологии.
Что касается практики, то вам потребуются:
1) мини-центрифуга (с вортексом), чтобы перемешивать пробирки, в которых находится смесь реактивов, а также чтобы осадить содержимое с реактивами и ДНК непосредственно до постановки ПЦР.
2) ПЦР-машинка.
3) В идеале ПЦР надо готовить в ПЦР-боксе, в котором есть ультрафиолет, с помощью которого можно продезинфецировать поверхности.
Все картинки приведены для примера, это оборудование производят разные фирмы.
Если есть выбор, то лучше купить ПЦР-машинку с градиентом, то есть в ней можно ставить ПЦР на разных температурах одновременно. Это необходимо, если вы заказали новые праймеры и хотите протестировать оптимальную температуру отжига.
Также вам понадобятся дозаторы объемом 200-1000, 20-200 и 1-20, либо 100-1000, 10-100, 1-10, что удобнее или что есть. И также наконечники соответствующих диаметров.
Из пластика еще понадобятся пробирки типа эппендорф на 1.5 мл, а также пцр-пробирки на 0.2 мл. Не забудьте про штативы для реактивов, что-то вроде этого:
Или этого
А также штативы для пцр-пробирок:
Что вам понадобится из реактивов?
1. Taq-полимераза и буфер к ней (обычно продаются вместе). Разбавлять не надо, но надо внимательно прочитать в инструкции, в какой концентрации их надо использовать в смеси.
2. Набор нуклеотидов. Обычно продается смесь всех четырех (dNTP). Будьте внимательны, часто их надо еще дополнительно разбавить, чтобы использовать для ПЦР. Например, если на пробирке написано X50, то их надо разбавить в 50 раз. Можно хранить пробирку с неразбавленными нуклеотидами в морозильнике, и когда понадобятся праймеры, размораживать ее, брать оттуда чуть-чуть, и разбавлять водой в новой пробирке. Однако нуклеотиды (как и любые реактивы, а также пробы) не рекомендуется размораживать слишком часто, поэтому можно разбавить сразу все нуклеотиды, распределив их по большому числу пробирок, и когда заканчивается одна, просто брать другую. Таким образом, пробирки размораживаются только тогда, когда их содержимое используется для постановки ПЦР. Такой вариант предпочтителен, но требует больше пространства для хранения. В некоторых лабораториях есть специальные морозильники для долговременного хранения реактивов.
3. Вода. Для реакций, где не нужна максимальная чистота, можно использовать воду для инъекций из аптеки. Если в лаборатории есть прибор для глубокой очистки воды MilliQ или аналоги, например, у нас есть российский РосОсмос, то можно использовать воду, очищенную таким образом. Если нужна вода, которая на 100% будет очищена от всего, ее можно купить на сайтах, где продаются реактивы. Обычно она очень дорогая, и если у вас деньги не лишние, лучше для начала попробовать более дешевые варианты.
4. Праймеры для участка ДНК, который вы хотите амплифицировать. Обычно они берутся из статей по близким группам, к тем, с которыми вы работаете, либо вы можете сконструировать последовательность праймеров сами для вашего случая. Праймеры поставляются сухими и их надо разбавлять, причем дважды. Количество воды, которое надо добавить к праймерам в первый раз, написано на бумаге, с которой они поставляются. Для того, чтобы использовать праймеры для реакции ПЦР, их надо разбавить еще раз, 1 к 9. То есть, к примеру, 10 мкл праймера на 90 мкл воды, или 20 мкл на 180 мкл, как удобнее. Тут схема такая же как с нуклеотидами. Можно хранить одну пробирку с праймерами, которые разбавлены один раз, и периодически отливать из нее по чуть-чуть, либо распределить весь объем по нескольким пробиркам и разбавить их сразу же и так хранить.
Заказать праймеры можно в разных организациях: Евроген, Бигль, Синтол (еще это называется "синтез олигонуклеотидов").
5. Ваша ДНК, которую вы выделили из ваших объектов. Она тоже хранится в морозилке, ее разбавлять не надо. (Про выделение ДНК я написала ранее, Часть 1 и Часть 2).
6. Опционально, MgCl, который можно добавить в микс для того, чтобы праймеры лучше связывались с ДНК.
Потом вам понадобится составить протокол, в котором будут указаны концентрации, в которых все эти реактивы смешаны. Часто он зависит от полимеразы, и надо прочитать инструкцию к той, что у вас. Обычно пояснения даются в молях, и если вы не понимаете, как с ними работать, то лучше обратиться к более продвинутому коллеге, чтобы он вам дал уже готовый протокол (если он использует такую же полимеразу) или помог вам рассчитать протокол для вашего случая.
В любом случае, нет никаких четких правил, какими должны быть концентрации. Если вы поищете информацию об этом в интернете, то увидите, что обычно даются разбросы концентраций, например .https://gatescientific.com/technique-geeks-blog/f/tuning-and-adjusting-pcr-reaction-mix
Мой протокол для полимеразы Евроген и Thermofisher на пробу:
Taq- полимераза - 0.1 мкл
Буфер - 2.5 мкл
Праймер 1 - 2 мкл
Праймер 2 - 2 мкл
Вода - 16.4 мкл
ДНК - 2 мкл
Всего у меня в пробирке 25 мкл на реакцию. Однако объемы на реакцию бывают разные, от 15 мкл до 100 мкл. От чего это зависит? Во-первых, это стоимость реактивов. Не хочется тратить их слишком много, потому что они не очень дешевые. Однако если у вас ткани не слишком свежие, лучше подготовить более 20 мкл, потому что чем меньше концентрация ДНК, тем больше объема ее раствора нужно для удовлетворительного секвенирования. Также обычно делают 30 мкл и больше, если делают очистку на колонках. Для этих целей минимальный рекомендованный объем 100 мкл (на самом деле можно использовать и 20 мкл). Еще всегда учитывайте, что 4-5 мкл уходит на постановку гель-электрофореза для проверки того, получилось ли у вас амплифицировать нужное и в каком объеме. Иногда объем на реакцию просто зависит от того, что используется в конкретной лаборатории. Если человека научили работать по определенному протоколу, он обычно с ним и работает и проводит эксперименты, только когда перестает получаться.
Обычно вы ставите ПЦР для более, чем одной пробы. Поэтому для удобства лучше сначала смешать все реактивы в так называемый "мастер-микс", который вы уже раскапаете в ПЦР-пробирки в нужном объеме для каждой пробы и каждого маркера.
Например, вы ставите ПЦР для одного маркера, у вас 10 проб. По моему протоколу вам надо будет добавить в пробирку с мастер-миксом следующие объемы реактивов:
Taq- полимераза - 1 мкл
Буфер - 25 мкл
Праймер 1 - 20 мкл
Праймер 2 - 20 мкл
Вода - 164 мкл
Получается 230 мкл. Все это смешать вместе, перемешать на вортексе. Потом раскапать в 10 отдельных подписанных пробирок (по номерам ваших проб) по 23 мкл, и добавить к каждой по 2 мкл ДНК соответствующей пробы. Таким образом, у вас будет по 25 мкл в каждой пробирке.
Перед постановкой ПЦР не забудьте осадить ДНК на вортексе, это очень важно. Если капля ДНК останется на стенке, то ПЦР не получится.