На основе камеры Мите он сконструировал свой фотоаппарат, позволявший трижды снимать один и тот же предмет в быстрой последовательности, используя красный, зеленый и синий фильтры.
В 1905 году он разработал и запатентовал собственный сенсибилизатор (вещество, повышающее чувствительность фотопленок, фотографических пластинок к цветным лучам), превосходивший по качеству иностранные разработки. В декабре 1906 года «Петербургская газета» сообщала, что, совершенствуя чувствительность своих пластин, исследователь предполагает демонстрировать «моментальные снимки в натуральных цветах, что представляет большой успех, так как до сего времени никем не получено».
Среди многочисленных достижений Прокудина-Горского в области цветной фотографии — уменьшение выдержки (ему удалось сделать возможной экспозицию за секунду), а также разработка технологии тиражирования снимка. Совместно с ученым Сергеем Максимовичем Прокудин-Горский работал над технологией цветного кино и запатентовал в Германии, Англии, Франции и Италии способ изготовления дешёвых цветных плёночных диапозитивов для кинематографии.
Наиболее известный фотопроект Прокудина-Горского — «Коллекция достопримечательностей Российской империи». Фотограф начал работать над ним еще в 1904 году, однако наибольший размах проект приобрел после того, как в мае 1909 года Прокудин-Горский продемонстрировал свои работы императору Николаю II. Фотограф получил в распоряжение от императора специально оборудованный вагон с темной комнатой (для проявки и печати снимков) и разрешения, обеспечивавшие ему доступ в запретные зоны. В 1909-1916 году Прокудин-Горский совершил несколько экспедиций в разные районы Российской империи. Сложности с финансированием и начавшаяся Первая мировая война не позволили ему в полной мере осуществить задуманное.
После Октябрьской революции Прокудин-Горский эмигрировал в Англию, а в 1922 году перебрался во Францию, где работал с братьями Люмьер. Умер в Париже в 1944 году и был похоронен на русском кладбище Сен-Женевьев-де-Буа.
Оставшаяся у наследников Прокудина-Горского часть его коллекции была продана Библиотеке Конгресса США, где хранится по сей день. В настоящий момент все негативы оцифрованы и доступны для просмотра на сайте Библиотеки.
В коллекции Мультимедиа Арт Музея находятся сорок фотооткрыток Сергея Прокудина-Горского и портрет Льва Толстого.