Флуоресцентная микроскопия – это оптический метод исследования объектов, где используется явление люминесценции или свечения. В основе лежит физический процесс, при котором вещество поглощает свет с одной длиной волны, и сразу после этого излучает свет уже с другой длиной волны. Соединения или фрагменты структуры, обладающие такими свойствами, называют флуорофорами.
Немного истории
Явление флуоресценции впервые обнаружил Джон Фредерик Уильям Гершель в 1845 году. Он заметил, что сам по себе бесцветный и прозрачный раствор хинина в солнечном свете излучает насыщенный небесно-голубой цвет. Открытие Гершеля заинтересовало британского учёного Джорджа Габриэля Стокса. Он продолжил исследование и обнаружил, что флуоресцентное излучение (эмиссия) объекта имеет бóльшую длину волны, чем свет, который первоначально возбуждает объект. Разница длин волн максимумов в спектрах поглощения и флуоресценции, открытая Стоксом в 1852 году, называется Стоксов сдвиг.
Первые флуоресцентные микроскопы сконструировали Август Кёлер (1904 год), Карл Райхерт и Оскар Хеймштадт (1911 год), а также Карл Цейсс и Генрих Леман (1913 год). Вначале учёные проводили исследования лишь с веществами, обладающими собственной флуоресценцией или аутофлуоресценцией. К таким веществам относится, например, аминокислота триптофан, входящая в состав большинства белков.
В 1930-х гг. появились первые флуоресцентные метки или зонды для маркировки нефлуоресцирующих объектов. В 1950-х гг. Альберт Кунс и Натан Каплан разработали метод обнаружения антигенов в тканях с использованием антител, меченных флуоресцентными красителями.
Сегодня флуоресцентная микроскопия применяется для решения разных задач, а оборудование и методы сильно превосходят те, с которых всё начиналось. В распоряжении учёных есть микроскопы с высоким разрешением и множество высокоселективных флуоресцентных зондов для маркировки самых разных объектов. (Рекомендуем статью: "Современные методы в генетическом анализе")
Особенности метода
Большинство компонентов клетки бесцветны и не чётко различимы под обычным микроскопом. С этой проблемой успешно справляется флуоресцентная микроскопия. Нужные для изучения структуры выделяют флуоресцентными метками – соединениями, поглощающими свет заданной длиной волны и после короткой задержки излучающими свет с большей длиной волны, чем поглотили. Например, если поглощается ультрафиолетовый свет, то излучаться будет синий свет или свет с ещё бóльшими значениями длин волн (зелёный, жёлтый, красный). Увеличение длины волны связано с тем, что в процессе поглощения-излучения теряется энергия, поэтому испускаемый фотон имеет меньше энергии, чем поглощённый. Чем ближе свет к красной зоне электромагнитного спектра, тем больше значение длины волны и меньше энергия фотонов.
Для каждого флуорофора характерны свои специфические спектры поглощения и излучения в зависимости от структуры молекулы и её окружения.
Флуоресцентная микроскопия превосходит методы исследования, при которых объекты окрашиваются поглощающими свет веществами. При использовании оптических красителей количество поглощённого света незначительно отличается от фона, поэтому получается трудноразличимое изображение с низким контрастом. А при исследовании с помощью флуоресценции можно увидеть даже отдельные макромолекулы. Флуоресцентная микроскопия позволяет избирательно исследовать отдельные компоненты в сложных биомолекулярных комплексах.
Чтобы увидеть расположение только флуоресцирующих объектов, излучаемый свет отсекают от возбуждающего специальным барьерным фильтром. При этом структуры, меченные флуоресцентными зондами, проявляются на чёрном фоне.
Более подробную информацию вы можете получить здесь.