Оригинальное название: Определение аллергенов в хлебе и макаронных изделиях методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрией
The Detection of Allergens in Bread and Pasta by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
Автор оригинальной статьи: Стивен Лок, Кэти Лейн и Фил Джексон из SCIEX, Уоррингтон, Чешир (Великобритания) и Антонио Сема из SCIEX, Мадрид (Испания)
Обзор
Сегодня рассмотрим быстрый, надежный, чувствительный и специфический ЖХ-МС/МС метод для одновременного обнаружения четырех основных пищевых аллергенов: арахиса, молока, пшеницы и яйца. Пептиды аллергенов можно обнаружить при низких концентрациях (уровнях частей на миллион (ppm)) после простой гомогенизации, расщепления трипсином и SPE очистки.
Введение
Распространенность пищевой аллергии в США оценивается примерно в 6% для детей и 3,7% для взрослых [1], и отчеты свидетельствуют о том, что количество пищевых аллергий возрастает. [2] Аллергены сами поступают из различных источников и представляют собой сложное сочетание различных химических веществ, но включают в себя белки из гречки, яйца, арахиса, злаков, содержащих глютен, древесные орехи, ракообразные, рыбу, сою, кунжут, горчицу и сельдерей, но также могут быть химическими веществами, такими как сульфиты. [3]
Аллергические реакции могут варьироваться от легкой до тяжелой и в течение 1999-2006 в Великобритании было зарегистрировано 48 случаев фатальных аллергических реакций. [4] В настоящее время оптимальным лечением при пищевой аллергии, — это избегание и самостоятельное лечение эпинефрином [5], поэтому среди производителей продуктов питания и регуляторов существует потребность в специфических и чувствительных методах выявления аллергенов в следовых количествах.
Кодекс по продуктам питания, Комиссия по пищевым стандартам для Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций и Всемирной организации здравоохранения, рекомендует всегда заявлять восемь потенциальных аллергенов в предварительно упакованных продуктах: арахис, орехи, яйца, молоко, злаки, содержащие глютен, моллюски, рыбу и сульфиты.
Скрининг пищи на аллергены традиционно проводится с использованием иммуноферментного анализа (ИФА - ELISA), в котором используются антитела против белков, специфичных для аллергенного пищевого продукта. [3,6] Качественный и количественный анализы обычно дают разные результаты, как ложноположительные, так и ложноотрицательные, что составляет серьезное ограничение для данной технологиию. Кроме того, для каждого целевого аллергена требуется отдельный тест-набор. Также для используется метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР). Недостаток заключается в том, что метод не определяет наличие аллергена непосредственно, а только биолологического материала из организма, который может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Очевидна необходимость метода, который мог бы однозначно подтвердить идентификацию нескольких аллергенных белков в пище одновременно. [7-8]
Изначально исследования с использованием жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS)[9] включали экстракцию, описанную Карери и соавторами [10]. Очень тррудоемкая и при применении на реальных образцах приводила к коэффициенту вариации (CV) > 20 % при низких уровнях аллергена.
В данном обзоре представлены данные после использования модифицированного и быстрого способа пробоподготовки, включающий в себя твердофазную экстракцию (SPE). Для упрощения эксперементов, разработка велась с использованием информации, предоставленной испытательной пищевой лабораторией. [11-12]
Экспериментальная часть
Стандарты
Для первоначальной разработки метода велась закупка целевых аллергенов, а при их отсустствии, покупался необходимый пищевой продукт (к примеру, арахис) и из него получали экстракт аллегенов. [9]
Пробоподготовка
Тестируемый образец, хлеб или макаронные изделия, гомогенизировали с использованием пищевого процессора, а затем к пробе добавляли необходимое количество белка аллергена для получения обогащенной пробы. Порошкообразную обогащенную пробу (5 г) смешивали с экстракционным буфером, содержащим бикарбонат аммония, мочевину и дитиотреитол. Смесь разрушали встряхиванием и дополнительно перемешивали с использованием роликовой мешалки.
Далее смесь центрифугировали и 1 мл надосадка смешивали с иодацетамидом, инкубировали в темноте в течение 20 мин и расщепляли белки добавлением соответствующего буфера , содержащего бикарбонат аммония, ацетонитрил и трипсин. После инкубации в течение ночи при 37°С пробу подкисляли и фильтровали.
Фильтрат очищали с использованием обычного кондиционированного полимерного SPE картриджа Phenomenex. Пептиды экстрагировали из картриджа с использованием ацетонитрила. Экстракт выпаривали досуха и восстанавливали в подкисленном водном ацетонитриле.
ЖХ
Вначале использовали ЖХ-систему Eksigent Technologies Tempo™ с ВЭЖХ колонкой обратной фазы C18 75 мм × 150 мм на уровне 300 нл/минут, используя градиент воды и ацетонитрила, где оба растворителя содержали муравьиную кислоту. ВЭЖХ-система использовалась для определения того, какие MRM-переходы были пригодны для обнаружения аллергенов.
Конечные экстрагированные образцы разделяли в течение 12-минутного градиента от воды к ацетонитрилу с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой на полярной эндкапированной колонке при скорости потока 300 мкл/мин, с использованием УВЭЖХ-системы Shimadzu. Как водная, так и ацетонитрильная подвижная фазы содержали муравьиную кислоту и трифторуксусную кислоту.
МС/МС
Все анализы были выполнены на системе ЖХ-МС/МС SCIEX 4000 QTRAP® с использованием ионизации электроспреем (ESI).
Первоначальную разработку метода осуществляли с использованием источника NanoSpray® при скорости потока 300 нл/мин. Использовалось программное обеспечение MRM Pilot™ вместе с рабочим процессом MIDAS™ (обнаружение MRM и секвенирование).
Используя рабочий процесс MIDAS™, из известной белковой последовательности был предсказан набор MRM-переходов. Его использовали в качестве обзорного сканирования для запуска сбора полных МС/МС спектров гибридной тройной квадрупольной линейной ионной ловушкой (QTRAP®) [рисунок 1]. Затем эти данные были переданы в поисковую систему базы данных для подтверждения идентификации пептидов и подтверждения осуществимости MRM-перехода для обнаружения аллергена. С помощью этого рабочего процесса были подобраны MRM-переходы без необходимости анализа синтетических пептидов. Они пригодились там, где не удалось приобрести необходимые белки.
Окончательный ЖХ-МС/МС метод для обнаружения аллергенов в образцах пищевых продуктов был выполнен на системе SCIEX 4000 QTRAP®, оснащенной источником Turbo V™ и зондом ESI со скоростью потока 300 мкл/мин.
Результаты и обсуждение
При разработке метода была предпринята попытка убедиться в том, что выбранные пептиды являются уникальными для аллергена. Список был дополнительно сведен путем удаления пептидов, которые могут быть восприимчивы к модификации во время обработки пищи, например, подвергнуться пост-трансляционной модификации или реакции Майяра. Это уменьшило количество пептидов, используемых в качестве триггеров для обнаружения и генерации пептидных отпечатков. Для каждого аллергена использовали несколько триггеров.
[Рисунок 2] показывает общую ионную хроматограмму для MRM-переходов, используемых для обнаружения белков арахиса, молока, яиц и пшеницы. Здесь показано в общей сложности 55 MRM-переходов, соответствующих 19 уникальным пептидам для аллергенов.
В этом методе использовался алгоритм Scheduled MRM™. Используя этот подход, каждый MRM отслеживается только в течение ожидаемого времени удерживания, уменьшая количество одновременных MRM-переходов в любой момент времени и поддерживая как время цикла, так и время задержки. [6] Этот подход максимизирует чувствительность и позволяет легко добавлять дополнительные маркеры аллергенов по мере масштабирования в будущем.
Конечный список MRM-переходов использовался в качестве обзорного сканирования и инициирования сбора МС/МС спектров QTRAP®. Эти спектры могут быть переданы в поисковые системы базы данных, предоставляя подтверждение идентификации пептидов.
Примеры проиллюстрированы в [рисунках 3а и 3b], где пробы макаронных изделий и хлеба были обогащены на 100 ppm аллергенами молока и яйца, проэкстрагированы и проанализированы.
Экстрагирование обогащенных макаронных изделий и хлеба дало идентичные МС/МС спектры для одних и тех же пептидов из яйца и молока. Эта дополнительная МС/МС информация вместе с данными о соотношении MRM дали несколько точек идентификации контаминации аллергенами в продуктах питания и, так как данные пептиды уникальны, был значительно снижен риск ложноположительной идентификации.
[Рисунок 4] иллюстрирует сравнение карт триптических пептидов трёх из четырёх рассматриваемых аллергенов.
Каждый белок аллергена производит различную пептидную карту с различной интенсивностью. Тот факт, что некоторые пептиды аллергена имеют более низкую интенсивность, будет означать, что пределы обнаружения будут варьироваться между различными аллергенами. На [рисунке 4] яичные пептиды вырабатывают сигналы меньшей интенсивности по сравнению с арахисом, и поэтому в молоке будет более высокий предел обнаружения.
Чтобы полностью оценить подход, пробы хлеба обогащали в различных концентрациях молоком и яичными белками (самая высокая и самая низкая чувствительность 4 аллергенов). Пробы обогащали в двух экземплярах и анализировали в трех экземплярах для оценки как линейности, так и надежности метода. В данном случае внутренние стандарты отсутствовали, поэтому все результаты не дают положительного эффекта от внутренней стандартизации. Результаты включают воспроизводимость ЖХ-МС/МС метода, а также протокол экстракции.
[Рисунки 5а и 5b] показывают, что пептиды яиц и молока дают линейный ответ. В этих тестах пептиды молока были обнаружены при менее чем 2 ppm, тогда как пептиды яиц имели предел обнаружения между 5 и 10 ppm.
СV пептида молока было меньше 5% при 100 ppm и меньше 10% при 10 ppm, что показывает, что вся процедура была воспроизводима [таблица 1].
Заключение
Был разработан быстрый, надежный, чувствительный и специфический ЖХ-МС/МС метод для одновременного обнаружения четырех основных пищевых аллергенов арахиса, молока, пшеницы и яйца. Первоначальная пробоподготовка была значительно упрощена. Обнаружение аллергенов в обработанных продуктах питания было возможно при низких уровнях содержания (ppm).
Достигнутая чувствительность была эквивалентна чувствительности некоторых доступных в настоящее время методов, основанных на ELISA и ПЦР в реальном времени, но CV без каких-либо внутренних стандартов были лучше, чем сообщалось ранее пользователями [9], и были значительно лучше, чем те, которые могут быть получены при низких уровнях ELISA.
ЖХ-МС/МС подход имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что он представляет собой мультиаллергенный скрининг в отличие от ELISA, где отдельные аллергены обнаруживаются отдельными наборами. Используя рабочий процесс MIDAS™, были получены спектры полного МС/МС сканирования QTRAP® одновременно с количественной информацией, подтверждающей идентификацию пептида и уменьшающей появление ложноположительных результатов, связанных с другими методами.
Источники
- Х.A. Сэмпсон: Журнал аллергии и клинической иммунологии 113 (2004) 805-819
- C. Хэдли: отчеты EMBO 7 (2006) 1080-1083
- A. Дж. Ван Хенгель: Аналитическая и биоаналитическая химия. 389 (2007) 111–118
- Р.С.Х. Памфри и М.Х. Голэнд: Журнал аллергии и клинической иммунологии 119 (2007) 1018-1019
- Р.С. Каган: Перспективы гигиены окружающей среды 111 (2003) 223-225
- Х. Чессейн, Дж. В. Норгаард, А.Дж. ван Хенгель: Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии 55 (2007) 4461-4473
- Дж. Хейк, М. Фишер и Б. Пёппинг: Журнал хроматографии А (2010) утвержденный
- Дж. Хейк: презентация на ежегодном собрании AOAC (2010) Орландо, Флорида
- C. Лейн, П. Дж. Джексон, Д. Поттс, Дж. Шталь-Дженг, A. Серна, Б. Поппинг и С.Дж. Лок: конференция ASMS (2008)
- M. Карери, Л. Элвири, M. Маффини, A. Манджа, C. Муччино, M. Теренги: Журнал «Rapid Commun. Mass Spectrom.» 22 (2008) 807- 811
- A. Коломбини, M. Меккьяри и М. Гатти: 1-й МС-пищевой день (2009) Парма, Италия
- M. Меккьяри, Неотрон: (2009) личная информация
Данные из материала можно использовать только для использования в научно-технических целях. Не для использования при проведении диагностических процедур! Для диагностики in vitro.
Упомянутые в настоящем документе товарные знаки и/или зарегистрированные товарные знаки являются собственностью SCIEX Pte. Ltd. или соответствующих владельцев на территории Соединенных Штатов Америки и/или в иных странах.
Упомянутые в обзоре товарные знаки и/или зарегистрированные товарные знаки являются собственностью AB Sciex Pte. Ltd. или соответствующих владельцев на территории Соединенных Штатов Америки и/или в иных странах. AB SCIEX™ используется в соответствии с лицензией. Авторское право 2010 DH Tech. Dev. Pte. Ltd.
Номер оригинальной публикации: 1830610-01