Одновременное определение антибиотиков в продуктах питания системой SCIEX Triple Quad 3500

Оригинальное название: Одновременное определение антибиотиков хлорамфеникола и тетрациклина в пробах продуктов питания с использованием системы SCIEX Triple Quad 3500

Simultaneous Analysis of Chloramphenicol and Tetracycline Antibiotics in Food Samples Using the AB SCIEX Triple Quad™ 3500 System

Автор оригинальной статьи: Андре Шрайбер из SCIEX Конкорд, Онтарио (Канада)

SCIEX Triple Quad 3500

Обзор

Использование жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) для анализа следов антибиотиков в образцах продуктов питания даёт много преимуществ обычным лабораториям по тестированию пищевых продуктов, включая возможность одновременного скрининга многих соединений, селективность метода для соответствия нормативным рекомендациям и чувствительность для сокращения времени пробоподготовки и для более быстрого получения результатов.

Система SCIEX Triple QuadTM 3500™ позволяет лабораториям, проводящим тестирование на антибиотики в продуктах питания, перейти на ЖХ-МС/МС и использовать ее многочисленные преимущества по приемлемой цене.

В данном обзоре представлен метод с использованием экстракции методом QuEChERS (для анализа проб молока, мяса и креветок) с наборами Phenomenex roQ и методом разбавления и прямого ввода пробы (для проб мёда), разделение с использованием колонки Kinetex Biphenyl 2.6 мкм (50 × 2,1 мм) и системы SCIEX Triple QuadTM 3500™ для обнаружения хлорамфеникола и тетрациклинов. Масс-спектрометр работал в режиме высокоселективного и чувствительного мониторинга множественных реакций (MRM). Пределы обнаружения (LOD) соответствовали нормативным пределам. Идентификация и количественное определение соединений достигались путем мониторинга двух или трех MRM-переходов для каждого аналита. MRM соотношение было автоматически рассчитано в программном обеспечении MultiQuant™.

Введение

Антибиотики широко используются в качестве агентов, способствующих росту, а также в качестве лекарственных средств против микробных инфекций. Присутствие антибиотиков в пище животного происхождения способно вызвать повышение бактериальной устойчивости к препаратам, а также вызвать гиперчувствительность к ним. Во всем мире установлены предельные допустимые уровни и максимальные остаточные уровни (MRL), и профильные агентства и организации контролируют снабжение для обеспечения того, чтобы концентрации следов антибиотиков не превышали эти уровни.

Методы на основе ЖХ-МС/МС для одного остатка и одного класса остатков используются для мониторинга ветеринарных препаратов в пище. Также были внедрены многоклассные методы мультиостаточного анализа для дальнейшего повышения эффективности мониторинга.[1-3]

Общие процедуры экстракции [4-5], сверхвысокоэффективные ЖХ-системы в сочетании с колонками частиц ядро-оболочка (core-shell), обеспечивающие оптимальное разрешение и явную форму пика, позволили обнаружить множество антибиотиков одним методом. Система ЖХ-МС/МС обычно используется в режиме MRM для повышенной чувствительности, селективности и скорости.

Система SCIEX Triple QuadTM 3500™ использует лучшие функции системы API 3200™ и расширяет их благодаря современной технике и электронике. Надежная конструкция источника Turbo V™ и интерфейса Curtain Gas™ обеспечивает исключительную надежность. Усовершенствованная электроника eQ™ и камера столкновений curved LINAC ® были разработаны для сверхбыстрой скорости обнаружения MRM и быстрого переключения полярности для комплексного многокомпонентного анализа.

Метод на основе тройного квадруполя для количественного определения хлорамфеникола и трех отобранных тетрациклинов был разработан с использованием селективного мониторинга множественных реакций (MRM) с активированным алгоритмом Scheduled MRM™. Соотношение переходов квантификатора и квалификатора использовали для идентификации соединения. Чувствительность обнаружения соответствовала существующим нормативным требованиям:

• максимальные предельные значения остатка (MRL) в соответствии с Кодексом по продуктам питания в 200 мкг/кг (ткань) и 100 мкг/л (молоко) для тетрациклинов
• предельные значения MRL в 50 мкг/кг, установленные китайским правительством, и минимальный рабочий предел обнаружения (MRPL) для хлорамфеникола, установленные Европейским союзом на уровне 0,3 мкг/кг. [6-8]

Метод успешно применялся при анализе проб молока, мяса, креветок и меда.

Экспериментальная часть

• Купленные в магазине образцы продуктов питания (молоко, мясо, креветки) экстрагировали по протоколу Европейского метода стандартов 156625 с использованием буферно-солевой смеси из набора Phenomenex roQ QuEChERS и набора dSPE (# KS0-8913), содержащих 150 мг MgSО4, 25 мг PSA и 25 мг C18.
• Экстракты, полученные методом QuEChERS, разбавляли водой 10:1 для минимизации возможных матричных эффектов.
• Образцы мёда разбавляли 5:1 водой и вводили непосредственно.
• Объем инжекции устанавливали равным либо 10, либо 50 мкл, в зависимости от целевого предела количественного определения.
• ЖХ-разделение было достигнуто с использованием колонки Phenomenex Kinetex Biphenyl 2,6 мкм (50 × 2,1 мм) и быстрого градиента воды и ацетонитрила с 0,1 % муравьиной кислотой при скорости потока, равной 0,5 мл/мин (градиентный профиль приведен в [таблице 1]).
• Система SCIEX Triple QuadTM 3500™ работала с источником Turbo V™ и зондом ESI, установленными на 500° C.
• Был осуществлен мониторинг двух MRM-переходов для хлорамфеникола и трех переходов для каждого тетрациклина (таблица 2).
• Алгоритм Scheduled MRM™ был активирован для достижения наилучшего качества данных.
• Использовалось быстрое переключение полярности на 50 мс. Напряжение IS было равно -4000 В и +5000 В соответственно.
• Для количественной и качественной обработки данных использовали программное обеспечение MultiQuant™ 3.0.

Таблица 1. Условия градиента, используемые для разделения

Таблица 2. MRM-переходы и время удерживания (RT), используемые для определения хлорамфеникола и татрациклинов

Результаты и обсуждения

Чувствительность, воспроизводимость, линейность и точность

Хроматограмма ЖХ-МС/МС стандарта растворителя 10 нг/мл показана на [рисунке 1] и отображает оптимальные разделение и форму пика, достигнутые с использованием колонки Phenomenex Kinetex Biphenyl с быстрым градиентом воды и ацетонитрила, с cодержанием 0,1 % муравьиной кислоты. Быстрое переключение полярности требовалось для обнаружения всех соединений в одном методе, поскольку хлорамфеникол (отрицательная полярность) и хлортетрациклин (положительная полярность) не были хроматографически разделены этим методом.

Рисунок 1. ЖХ-разделение и определение в режиме MRM трех тетрациклинов и хлорамфеникола при 10 нг/мл

[Рисунки 2 и 3] показывают достигнутую чувствительность ко всем целевым антибиотикам. Тетрациклины могут быть легко количественно определены в целевом MRL с использованием небольшого вводимого объема 10 мкл - уменьшение матричной нагрузки для масс-спектрометра для повышения устойчивости и уменьшения потенциального подавления ионов.

Однако для хлорамфеникола иногда требуется больший объем инжекции, чтобы соответствовать целевому MRPL, в то же время обеспечивая достаточное разбавление для минимизации потенциальных матричных эффектов. В этих случаях использовали вводимый объем 50 мкл.

Рисунок 2. Чувствительность 5 нг/мл стандарта тетрациклинов (вводимый объем 10 мкл)

Рисунок 3. Предел количественного определения хлорамфеникола менее 0,05 нг/мл с вводимым объемом 50 мкл, позволяющим разведение матричных экстрактов 10:1

Калибровочные кривые показаны на [рисунке 4] в диапазоне от 0,05 до 100 нг/мл для хлорамфеникола и от 0,1 до 100 нг/мл для тетрациклинов, соответственно, с коэффициентом регрессии > 0.997.

Рис. 4. Калибровочные кривые для всех 4 соединений, анализируемых в данном исследовании

Точность для всех калибровочных стандартов была между 80 и 120 %, и было обнаружено, что повторяемость была выше 5 % CV и при LOQ (n = 3).

Достигнутые характеристики метода позволили разбавить экстракты проб 10:1 для уменьшения возможных матричных эффектов. Для компенсации матричных эффектов рекомендуется дополнительное использование изотопных маркированных внутренних стандартов.

Результаты в образцах продуктов питания

На рис. 5 и 6 показаны матричные пробы, испытанные отрицательно на хлорамфеникол и тетрациклины. Проба меда имела следовое загрязнение хлорамфениколом ниже LOQ 0,05 нг/мл (0,25 мкг/кг в матрице после 5-кратного разбавления во время пробоподготовки).

Рисунок 5. Пустые матрицы, испытанные на хлорамфеникол (инжекция 50 мкл), в пробе меда было следовое загрязнение хлорамфениколом ниже LOQ 0,05 нг/мл (0,25 мкг/кг в матрице после 5-кратного разбавления)

Рисунок 6. Пустые матрицы, испытанные на тетрациклины (инжекция 10 мкл)

Примеры хроматограмм различных проб продуктов питания, обогащенных антибиотиками, представлены на [рисунках 7 и 8]. Идентификация соединений основана на критериях директивы 2002/657/ЕС9 (допустимое значение времени удерживания ±2,5% и максимальных допустимых значений соотношений ионов от ±20 до 50% в зависимости от соотношения). Все результаты количественного и качественного анализа были автоматически рассчитаны в программном обеспечении MultiQuant™. [рисунок 6][10]

Рисунок 6. Настройка допустимых соотношений MRM в редакторе метода программного обеспечения MultiQuantTM

Рисунок 7. Различные экстракты продуктов питания, обогащенные хлорамфениколом при 0,1 мкг/кг (инжекция 50 мкл/кг), допуски отношения MRM отображаются в окне обзора пиков.

Рисинок 8. Параллельный обзор пиков инжекции стандарта (слева) и обогащенных экстрактов мяса (середина и справа) с автоматическим расчетом соотношений MRM, допустимые значения соотношений MRM отображены в окне просмотра пика

Заключение

Метод ЖХ-МС/МС для идентификации и количественного определения антибиотиков был разработан и успешно применен к различным пробам продуктов питания, включая мёд, молоко, креветки и мясо.

Метод состоит из экстракции методом QuEChERS с последующим разбавлением для минимизации возможного подавления ионов и подхода разбавления и прямого ввода пробы для меда. Система SCIEX Triple QuadTM 3500™ работала в режиме MRM и с использованием алгоритма Scheduled MRM™ для определения. Пределы обнаружения (LOD) соответствуют нормативным требованиям. Осуществлялся мониторинг от двух до трех MRM-переходов для каждого аналита, а соотношение переходов квантификатора и квалификатора было использовано для идентификации. Обработка данных была осуществлена с помощью программного обеспечения MultiQuant™. Для идентификации использовались критерии идентификации директивы 2002/657/EC.

Источники

1. Л. Родзиевич и И. Завадска: «Быстрое определение следов хлорамфеникола в меде методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии и валидация метода на основе 2002/657/EC' APIACTA 42 (2007) 25-30
2. П. Венкатеш и соавторы: «ЖХ-МС/МС анализ антибиотиков тетрациклина в креветках (Penaeus monodon) из прибрежного региона южной Индии» Journal of Pharmacy Research 6 (2013) 48-52
3. Мэрилин Шнайдер и соавторы: «Оценка метода многоклассовой, многоостаточной жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии для анализа 120 ветеринарных препаратов в почках крупного рогатого скота» Тест на лекарственные препараты. Анализ 4 (2012) 91-102
4. Б. Кинселла и соавторы: «Новый метод для анализа флукицидов и прочие противогельминтные след в молоке и печени крупного рогатого скота с использованием жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии» Analytica Chimica Acta 637 (2009) 196-207
5. Б. Берендсен и соавторы: «Селективность в пробоотготовке для анализа следов лекарственных препаратов в продуктах животного происхождения с использованием ЖХ-МС» Тенденции аналитической химии 43 (2013) 229239
6. Codex Alimentarius Комиссия CAC/MRL 2-2012: «Максимальные пределы остатков для ветеринарных препаратов в продуктах питания» 2012
7. GB/T 2131 7-2007: «Определение остатков тетрациклинов в продуктах питания животного происхождения. Метод ЖХ-МС/МС и метод УВЭЖХ» (2007)
8. 2003/181/EC: «Настройка минимальных рабочих пределов обнаружения (MRPL) для определенных следов в продуктах питания животного происхождения» (2003)
9. 2002/657/EC: «О проведении аналитических методов и интерпретация результатов» (2002)
10. A. Шрайбер: «Программное обеспечение MultiQuant™, версия 3.0 – улучшение качества и скорости обработки данных с лучшим интегрированием пика. Обзор количественного и качественного определения соединений для анализа продуктов питания, питьевой воды и экологических проб» Указание по применению АВ SCIEX (2013) 8160213-01

Данные из материала можно использовать только для использования в научно-технических целях. Не для использования при проведении диагностических процедур! Для диагностики in vitro.

Упомянутые в настоящем документе товарные знаки и/или зарегистрированные товарные знаки являются собственностью SCIEX Pte. Ltd. или соответствующих владельцев на территории Соединенных Штатов Америки и/или в иных странах.

Торговые марки и/или зарегистрированные торговые марки, указанные в данном документе, являются собственностью AB Sciex Pte. Ltd или их соответствующих владельцев, в США и/или определенных прочих странах. AB SCIEXTM используется по лицензии © 2014 DH Tech.Dev.Pte.Ltd.

Номер оригинальной публикации: 10641514-01