Количественный анализ и идентификация пестицидов в пищевых образцах ЖХ-МС/МС-методом (Sheduled MRM™)

Comprehensive Quantitation and Identification of Pesticides in Food Samples using LC-MS/MS with Scheduled MRM™, Fast Polarity Switching, and MS/MS Library Searching

Авторы оригинальной статьи: Андре Шрайбер и Юнь Юнь Цу (SCIEX, Конкорд, Онтарио, Канада)

Фото Soo Ann Woon (https://unsplash.com/photos/SgWcfBA1Be8)

Обзор

Жидкостная хроматография вместе с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) широко используется в качестве аналитического метода для скрининга остаточных количеств препаратов и других нежелательных примесей в продуктах питания.

Нижепредставленный метод, протестированный на системе SCIEX QTRAP® 5500, включающий в себя экстракцию аналитов с помощью протокола QuEChERS, разделение их на колонке С18 с привитой полярной фазой и последующее МС/МС сканирование в режиме высокоселективного и чувствительного мониторинга множественных реакций (MRM).

При разработке метода, для получения лучших качественных данных использовался алгоритм Scheduled MRM™, совмещенный с функцией быстрого переключения полярности и применяющийся к широкому диапазону возможных пестицидов. При этом, МС/МС спектры были получены для проведения надежной идентификации вещества на основе установления совпадения по библиотеке масс-спектров.

Введение

ЖХ-МС/МС представляет собой мощный аналитический инструмент, способный проводить скрининг образцов для выявления большого перечня веществ. MRM обычно используется из-за своей высокой чувствительности, селективности и скорости, а также гибкости, которая позволяет адаптировать анализы под современные запросы.

Разработка общих процедур экстракции: QuEChERS, ЖХ-методов при использовании модифицированных фаз C18 с привитыми полярными группами с оптимальным разрешением и явной формой пика, предоставила возможность выявлять пестициды различных классов, с различными химическими характеристиками в одном образце.[1-3]

Современные ЖХ-МС/МС системы делают возможным определять сотни пестицидов и иных остаточных веществ в пищевых образцах за один закол. Источник Turbo V™ с интерфейсом Curtain Gas™ для снижения химического шума, коллизионная ячейка LINAC® для быстрого МС/МС сканирования — являются ключевыми технологиями в ЖХ-МС/МС системах SCIEX для проведения эффективных опытов. А современное программное средство, алгоритм Scheduled MRM™, интеллектуально использует информацию о времени удерживания для автоматической оптимизации времени измерения каждого MRM-перехода и общего времени цикла, в результате чего получаются высокоточные данные.

Для еще большего увеличения надежности аналитических результатов используется технология QTRAP® для автоматического быстрого и чувствительного снятия МС/МС-спектров в режиме EPI, после чего проходит поиск по библиотекам масс-спектров для идентификации вещества. Информация о полной молекулярной структуре, хранящаяся в спектрах EPI, значительно уменьшает риск ложноположительных результатов.[4-6]

Для проведения обширного скрининга пестицидов необходимо использовать оба режима электрораспыления - положительно и отрицательно заряженных ионов.

В данном обзоре используется метод ЖХ-МС/МС, вкупе с алгоритмом Scheduled MRM™ и быстрым переключением полярностей, в условиях накопления МС/МС-спектров для идентификации вещества. Метод был успешно применен для количественного расчета и идентификации пестицидов в ряде QuEChERS экстрактов из фруктов, овощей и специй.

Подробная информация о методе

Для различных образцов фруктов и овощей проводилась модифицированная процедура экстракции QuEChERS, а также разбавление в 10-15 раз водой.

• Набор стандартов SCIEX iDQuant™ для анализа пестицидов использовался для настройки метода и подготовки калибровочных стандартов. Были добавлены дополнительные пестициды для работы со всеми интересующими веществами.
• Разделение ЖХ проходило на системе Shimadzu UFLCXR с колонкой Restek Ultra Aqueous C18 3 мкм (100×2,1 мм), градиент: 15 минут, вода и метанол с буфером из формиата аммония, скорость потока 0,5 мл/мин. Объем инжекции 10 мкм.
• Система SCIEX QTRAP® 5500 с источником Turbo V™ и зондом электрораспылительной ионизации (ESI). 386 переходов в положительной полярности и 56 переходов в отрицательной полярности прошло мониторинг со временем паузы MRM — 2 мс. Оптимизированные переходы для всех веществ были получены через каталог MRM теста iMethod™ для скрининга пестицидов, версия 2.1.
• Алгоритм Scheduled MRM™ использовался с окном MRM-определения 90 с, целевое время сканирования 0,3 с в программном обеспечении Analyst® 1.6.
• Переключения полярности: 50 мс.
• Для надежности идентификации вещества были получены спектры EPI при скорости сканирования 10000 Да/с при использовании динамического времени заполнения для оптимального качества МС/МС.
• Спектры EPI сгенерированы при использовании стандартизированной коллизионной энергии (СЕ) ±35 В, распределение энергии соударений (CES) 15 В, для обеспечения характерных МС/МС спектров вне зависимости от эффективности фрагментации вещества. МС/МС спектры были пропущены через библиотеку пестицидов iMethod™, версия 2.1.
• Программное обеспечение MultiQuant™ 2.1 использовалось для обработки количественных данных.

Рисунок 1. Определение пестицидов при концентрации 1 нг/мл путем мониторинга 442 MRM-переходов в положительной и отрицательной полярности при использовании алгоритма Scheduled MRM™ и быстрого переключения полярностей

Результаты

Scheduled MRM™ и быстрое переключение полярностей

Алгоритм Scheduled MRM™ использует информацию об удержании каждого аналита для мониторинга каждого MRM-перехода только в узком временном окне. Таким образом, в любой промежуток времени количество одновременных MRM-переходов значительно уменьшается, что увеличивает количество рабочих циклов для каждого аналита.

Программное обеспечение высчитывает максимальное время измерения для совместно элюируемых веществ, при поддержании желаемого времени цикла для лучшего отношения «сигнал-шум», для лучшей точности и воспроизводимости. В результате Scheduled MRM™ позволяет проводить мониторинг множества MRM-переходов за один закол без потери качества данных. [рисунок 2] [4]

Рисунок 2. Алгоритм Scheduled MRM™ использует сведения об элюировании каждого аналита для мониторинга MRM-переходов только в узком окне времени удерживания. Это позволяет провести мониторинг большего количества MRM-переходов за один цикл ЖХ при поддержании максимального времени измерения и оптимального времени цикла.

Усовершенствованная версия алгоритма Scheduled MRM™, предложенная в ПО Analyst® 1.6, позволяет совмещать распределение MRM переходов по времени с быстрым переключением полярностей для дальнейшего расширения панели веществ за счет включения в метод множества веществ с различными химическими свойствами.

Создание метода

Ключевым преимуществом алгоритма Scheduled MRM™ является простота, с которой создаются мощные методы сбора количественных MRM-данных. Необходимо указывать следующие параметры [рисунок 3]:

• MRM-переход: (Q1, Q3) и любые зависимые от вещества параметры в обеих полярностях;
• Ожидаемое время удерживания для каждого MRM-перехода;
• Окно MRM-определения должно быть достаточно широкое для полного расположения MRM-пика внутри окна на протяжении всех заколов;
• Целевое время сканирования для каждой полярности с целью настройки полного рабочего цикла;
• Идентификация MRM, например, название вещества, для упрощенной обработки данных и составления отчетов.

Рисунок 3. В интерфейс метода сбора данных для Scheduled MRM™, в дополнение к стандартным параметрам MRM, пользователь вводит время удержания всех аналитов, заполняет данные об окне MRM-определения и о целевом времени сканирования. Далее программное обеспечение автоматически разрабатывает и оптимизирует метод накопления Scheduled MRM™.

Алгоритм программного обеспечения далее автоматически строит метод сбора данных, в рамках которого строится график MRM-переходов для мониторинга, также необходимые полярности переключаются в установленное время в течение хроматографического анализа.

Высококачественное и высоковоспроизводимое ЖХ-разделение является ключевым моментом для оптимального проведения МС/МС анализа.

Для автоматического создания метода Scheduled MRM™ пользователю необходимо ввести в программу данные окна MRM-определения, а именно, расчет ширины пика ЖХ и ожидаемую хроматографическую воспроизводимость, далее отображается окно времени для предложенного времени удержания, которое будет охватывать весь ЖХ-пик и предусматривать его сдвиги при изменении хроматографических условий. Чем уже ширина пика и чем воспроизводимее элюирование, тем уже может быть окно MRM-определения, и таким образом, меньшее количество одновременных MRM-переходов будет проходить мониторинг. Уменьшенное количество одновременных MRM-переходов также означает увеличение времени измерений для каждого MRM, что улучшает качество данных.

Характеристики количественного метода

Разработанный ЖХ-МС/МС метод позволил получить необходимые количественные данные. Калибровочные стандарты были введены в диапазоне 0,1-100 нг/мл. Для максимального уровня остатка 10 мгк/кг предел количественного определения (LOQ) будет зависеть от коэффициента разведения экстракта. Здесь мы использовали 10х, 20х, 50х разведение соответственно, в зависимости от анализируемой матрицы. Таким образом для разведения 50х, предел количественного определения (LOQ) составлял не более 0.2 нг/мл. Образцы хроматограмм пестицидов, определенных при заколе стандарта с концентрацией 0,2 нг/мл с использованием двух MRM-переходов. [рисунки 4 a-d]

Рисунок 4а. Калибровочные кривые для MRM-перехода квантификатора и квалификатора ометоата от 0,1 до 100 нг/мл

Рисунок 4b. Калибровочные кривые для MRM-перехода квантификатора и квалификатора трифлоксистробина от 0,1 до 100 нг/мл

Рисунок 4с. Калибровочные кривые для MRM-перехода квантификатора и квалификатора спинозина А от 0,1 до 100 нг/мл

Рисунок 4d. Калибровочные кривые для MRM-перехода квантификатора и квалификатора дифлубензурона от 0,1 до 100 нг/мл

Калибровочные стандарты были введены в концентрациях от 0,1 до 100 нг/мл [рисунки 4 a-d]. Была достигнута точность в диапазоне 80-120 % для всех целевых пестицидов на всем диапазоне калибровки. Для нескольких пестицидов со слишком слабой или наоборот сильной ионизацией были исключены самая нижняя и самая высокая точки, соответственно.

Воспроизводимость исследовалась путем повторных инжекций при 1 и 10 нг/мл (n=5). Коэффициенты вариаций (% CV), как правило, были ниже
10 % для обоих MRM-переходов.

Количественные результаты доказывают преимущества совмещения Scheduled MRM™ с быстрым переключением полярностей для обширного многоцелевого количественного скрининга.

Результаты анализа образцов фруктов и овощей

Разработанный метод применялся для количественного анализа пестицидов в реальных пищевых экстрактах. Образцы хроматограмм показаны на рисунках 5 а-е. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Отчет об обнаруженных пестицидах в реальных вышеуказанных образцах, 1 мгк/кг (выделены результаты выше максимально допустимого уровня остатков, 10 мгк/кг) *идентифицирован как ложноположительный в результате поиска по библиотеке МС/МС-спектров

Рисунок 5а. Образец груши (экстракт в 10х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов при использовании Scheduled MRMTM и функции быстрого переключения полярностей; идентифицированные и количественно рассчитанные пестициды приведены в таблице 1.

Рисунок 5b. Образец органической малины (экстракт в 10х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов при использовании Scheduled MRMTM и функции быстрого переключения полярностей; идентифицированные и количественно рассчитанные пестициды приведены в таблице 1.

Рисунок 5с. Образец моркови (экстракт в 10х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов при использовании Scheduled MRMTM и функции быстрого переключения полярностей; идентифицированные и количественно рассчитанные пестициды приведены в таблице 1.

Рисунок 5d. Образец порошка-карри (экстракт в 50х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов при использовании Scheduled MRMTM и функции быстрого переключения полярностей; идентифицированные и количественно рассчитанные пестициды приведены в таблице 1.

Рисунок 5е. Образец изюма (экстракт в 20х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов при использовании Scheduled MRMTM и функции быстрого переключения полярностей; идентифицированные и количественно рассчитанные пестициды приведены в таблице 1.

Данные были обработаны программным обеспечением MultiQuant™ 2.1, с запросом «многокомпонентный». Файлы запроса являются настраиваемыми командами для удовлетворения запроса пользователя в форме таблицы с результатами. Запрос «многокомпонентный» использовался для автоматического расчета и сравнения MRM-соотношений для идентификации веществ, для выделения концентраций выше установленного максимально допустимого уровня остатков. Пример результатов и обзор пика после обработки файла запроса представлен на [рисунке 6].

Рисунок 6. Результаты и обзор пика после обработки запроса «многокомпонентный» в программном обеспечении MultiQuantTM. На рисунке представлен пример анализа изюма и пестицидов, выявленных в концентрациях выше установленного максимально допустимого уровня, 10 мгк/кг, и идентифицированных посредством автоматического расчета MRM-соотношений (для получения полной картины о результатах сравнить с рисунком 5d и таблицей 1)

Идентификация вещества при использовании поиска по библиотеке МС/МС-спектров

Несмотря на высокую селективность MRM-определения, всегда существует риск ложноположительных результатов, ввиду наличия матричных помех. Обычно второй MRM-переход анализируется для аналита, отношение переходов квантификатор / квалификатор рассчитывается для каждого неизвестного образца и сравнивается с MRM-отношением стандартов для идентификации. Тем не менее, сообщается, что учет только MRM-отношений при идентификации может привести к значительному количеству ложноположительных результатов, особенно если у целевых аналитов низкая эффективность фрагментации (множество малоинтенсивных дочерних ионов).[7-9]

Для увеличения точности идентификацию можно проводить с помощью полного МС/МС сканирования и поиска по библиотеке для сравнения неизвестного вещества со стандартным спектром. В данном обзоре использовались МС/МС-спектры, полученные в режиме EPI на системе SCIEX QTRAP® 5500, проводился поиск по библиотеке масс-спектров для увеличения надежности определения. Примеры спектров и поиск по библиотеке при использовании нового улучшенного алгоритма поиска представлены на [рисунке 7].

Рисунок 7а. Образец органической малины (экстракт в 10х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов с помощью поиска по библиотеке МС/МС-спектров; результаты обеспечивают дополнительную надежность при идентификации вещества

Рисунок 7b. Образец моркови (экстракт в 10х разведении) прошел скрининг на наличие пестицидов с помощью поиска по библиотеке МС/МС-спектров; результаты обеспечивают дополнительную надежность при идентификации вещества

Дополнительный эксперимент, проведенный с помощью сканирования и поиска по МС/МС библиотеке, позволил провести идентификацию ложноположительного результата для образца моркови. Ометоат не присутствовал в образце, хотя время удержания и MRM-отношение ометоата были идентичными обнаруженному пику в экстракте. Рисунок 8 демонстрирует сравнение MRM-хроматограмм с МС/МС-спектрами.

Рисунок 8. Ложноположительный результат, обнаруженный при поиске по библиотеке МС/МС-спектров; стандарт и образец моркови имеют идентичное время удержания 1,7 мин и MRM-отношение 0,6, однако спектры МС/МС отличаются; результаты поиска четко доказывают ложноположительный результат.

Заключение

Метод ЖХ-МС/МС, использующий алгоритм Scheduled MRM™ в комбинации с быстрым переключением полярностей и получение ЖХ-МС/МС-спектров для идентификации вещества, имеет значительные преимущества. Метод успешно использовался для количественного расчета и идентификации пестицидов, учитывал широкий диапазон химических свойств веществ, в том числе получение спектров в положительном и отрицательном режиме.

Автоматически настраиваемый метод, основанный на алгоритме Scheduled MRM™, обеспечил качественным количественными данными. Пределы количественного определения (LOQ) были измерены для всех пестицидов при содержании 0,1 нг/мл и ниже. Такие показатели позволяют проводить 50х разведение экстрактов, что значительно уменьшает матричные помехи и интерференции. Точность установлена между 80 и 120 % с % CV менее 10%.

Различные образцы фруктов, овощей и специй были проанализированы после экстрагирования методом QuEChERS и последующего разведения.

Результаты были обработаны при использовании программного обеспечения MultiQuant™ c запросом «многокомпонентный». Запрос автоматически отмечает результаты, превышающие пределы, установленные пользователем (максимально допустимый уровень), и при положительной идентификации, основанной на сравнении MRM-отношений.

К тому же, с помощью системы SCIEX QTRAP® 5500 были получены полные МС\МС спектры во всем массовом диапазоне.

• МС/МС спектры содержат полную молекулярную структуру каждого аналита.
• Поиск по библиотеке спектров уменьшает возможность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Данная процедура позволила идентифицировать и скорректировать один ложноположительный результат в одном из образцов.

Источники

1. М. Анастассиадес и соавторы: АОАС Int. 86 (2003), 412-431
2. А. Шрибер и Ребекка Уиттриг: Сельскохозяйственные продукты питания 21 (2010) 16-19
3. Дж. Уонг и соавторы: Дж. Агрик. Химия пищевых продуктов 58 (2010), 5897-5903
4. А. Шрибер и Надя Пейс: Указание по использованию AB SCIEX (2010), 1282310-01
5. К. фон Чапевски и соавторы: Указание по использованию AB SCIEX (2011), 2110211-01
6. А. Шрибер и соавторы: Указание по использованию AB SCIEX (2010), 1121010-01
7. М. Дж. М. Буэно и соавторы: Аналитическая химия 79 (2007), 9372-9384
8. А. Шурманн и соавторы: Быстрая масс-спектрометрия 23 (2009), 1196-1200
9. М. Грос и соавторы: Аналитическая химия 81 (2009), 898-912

Данные из материала можно использовать только для использования в научно-технических целях. Не для использования при проведении диагностических процедур! Для диагностики in vitro.

Упомянутые в настоящем документе товарные знаки и/или зарегистрированные товарные знаки являются собственностью SCIEX Pte. Ltd. или соответствующих владельцев на территории Соединенных Штатов Америки и/или в иных странах. AB SCIEX™ используется в соответствии с лицензией. Авторское право 2010 DH Tech. Dev. Pte. Ltd.

Номер оригинальной публикации: 3370411-01