Simultaneous Analysis of 10 Mycotoxins in Crude Extracts of Different Types of Grains by LC-MS/MS
Авторы оригинальной статьи: Дороте Эльберт и Кристин фон Чапевски (SCIEX, Дармштадт, Германия), Ингрид Буяра, Юрген Кунзе и Анджела Джиджер (SGS Germany GmbH, Гамбург, Германия)
Обзор
В данном материале продемонстрирован валидированный метод ЖХ-МС/МС по выявлению 9 токсинов, вырабатываемых грибами рода Fusarium (Фузариум), и охратоксина А в разбавленных неочищенных экстрактах зерна.
Пробоподготовка быстрая, простая, надежная и недорогая. Метод ЖХ-МС/МС в режиме Мониторинга Множественных Реакций (ММР - MRM) выявляет все вещества за один рабочий цикл, предел количественного определения: 0,3 мкг/кг – 10 мкг/кг.
Метод утвержден для анализа образцов пшеницы, ржи, ячменя и овса.
Введение
Микотоксины вредны для здоровья человека и животного. Они либо канцерогенные, либо цитотоксические и наносят вред иммунной системе.
Зерновые культуры часто загрязнены охратоксином А и токсинами Fusarium. Токсины, выделяемые грибами Fusarium, можно встретить во всех видах зерна: пшеница, рожь, кукуруза, ячмень (солод) и овес. Контаминация зависит от условий климата во время выращивания, процесса сбора урожая и его хранения. К примеру, из-за плохих погодных условий в 2007 году, в Германии был обнаружен высокий уровень загрязнения пшеницы дезоксиниваленолом (DON), а пшеницы и овса – Т2 и НТ-2.
Ввиду этого различные государства установили нормы в отношении содержания микотоксинов. Пределы содержания микотоксинов для Европейского Союза согласованы в постановлении о нежелательных примесях в продуктах питания (ЕС 1881/2006 от 19 декабря 2006 года) с последующими поправками (ЕС 1126/2007 от 28 сентября 2007 года). Законодательство и Европейская программа мониторинга фокусируется на таких токсинах Fusarium как дезоксиниваленол, зеараленон, НТ-2 и Т-2, ввиду их частого и возрастающего применения. Для последних двух Европейская комиссия 1 июля 2008 года установила максимально допустимые уровни их содержания. Предел для обоих токсинов Fusarium Т-2 и НТ-2: не более 50 мкг/кг. [1-3]
Очевидна необходимость надежного, чувствительного, эффективного и быстрого метода анализа большого количества микотоксинов в зерне. Существующие методы не показывали необходимой производительности. А для очистка с использованием иммуноаффинных колонок необходимо много временных и финансовых затрат.
Поэтому был разработан метод выявления 9 токсинов, вырабатываемых грибами Fusarium: DON, зеараленон (ZON), 3-ацетил-дезоксиниваленол (3-AcDON), 15-ацетил-дезоксиниваленол (15-AcDON), НТ-2, Т-2, фузаренон-Х (FUS X), ниваленол (NIV), диацетоксисцирпенол (DAS) и охратоксин А (ОТА) [рисунок 1].
- Разбавленные неочищенные экстракты прошли анализ при использовании жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) за один рабочий цикл с помощью системы ЖХ-МС/МС API 4000 ™.
- Для проведения анализа не требуется много времени и затрат на подготовку пробы.
- Метод был утвержден для пшеницы, ржи, ячменя и овса.
- В рамках данного метода было проанализировано около 220 проб зерна.
- Предел количественного определения варьируется между
0,3 мкг/кг и 10 мкг/кг в зависимости от вещества.
Условия эксперимента
Подготовка пробы
- Измельчить и гомогенизировать 10 г зерна.
- Добавить 40 мл ацетонитрила / воды (84/16).
- Для экстракции смешивать в течение 90 минут (220 оборотов в минуту).
- Отфильтровать с помощью Whatman S&S 1573 1⁄2.
- Разбавить фильтрат 1:10 с водой + 5 ммоль ацетата аммония.
- Ввести 100 μл в систему ЖХ-МС/МС.
Условия ВЭЖХ
- Использовалась система ЖХ Shimadzu Prominence, состоящая из контроллера системы, двух насосов, дегазатора, автосамплера и термостата колонок.
- Разделение проходило на колонке Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18, 100×4,6 мм (1,8 μм).
- Установленная температура термостата колонки: 40 °C.
- Градиент: элюент А = вода + 5 ммоль ацетата аммония,
элюент В = метанол + 5 ммоль ацетата аммония. - Cкорость потока 500 μл/мин.
- Сведения о градиенте приведены в таблице 1.
- Объем инъекции 100 μл.
Условия МС/МС
Использовалась система ЖХ-МС/МС АPI 4000™, оснащенная источником Turbo V™ и зондом для электрораспылительной ионизации.
Метод состоит из трех периодов с изменением полярностей (0,0 - 7,6 мин отрицательная; 7,6 - 9,2 мин положительная; 9,2 - 16,0 мин отрицательная).
Использовались следующие параметры ионного источника:
- Температура 600 °C
- Газовая завеса: 25 psi, Газ 1: 50 psi, Газ 2: 70 psi, Газ CAD: 6 (положительная) или 10 (отрицательная), напряжение IS: +5000 В или -4000 V, соответственно.
- Все микотоксины были обнаружены при использовании двух MRM-переходов в следующем порядке:
- первый период NIV, DON, FUS X, AcDON;
- второй период DAS, OTA, HT-2, T-2;
- третий период ZON. - Так как 3-AcDON и 15-AcDON не разделились во время проведения хроматографии, для определения использовались специальные переходы соединений. Использованные MRM-переходы приведены в [таблице 2], спектры дочерних ионов 3-AcDON и 15-AcDON показаны на [рисунке 2].
Результаты и обсуждение
На [рисунке 3] приведена стандартная хроматограмма 9 токсинов Fusarium при 50 мкг/кг и охратоксина А при 10 мкг/кг. Во время оценки было установлено, что чувствительность MRM-переходов зависит от качества используемых растворителей, также от анализируемых матриц.
AcDON, DON, FUS X и NIV обычно показывают хорошую чувствительность для [M+CH3COO]- и [M-H]-. Тем не менее, для лучшего отношения «сигнал-шум», воспроизводимости и извлечения были использованы MRM-переходы, перечисленные в [таблице 2] выше.
Специальная характеристика ионизации была обнаружена для НТ-2. Чувствительность MRM [M+NH4]+ или [M+Na]+ отличается в зависимости от анализируемой матрицы [рисунок 4].
Предел количественного определения был установлен для ОТА: 0,3 мкг/кг, для НТ-2, Т-2 и ZON: 5 мкг/кг, для AcDON, DON, FUS X, DAS и NIV: 10 мкг/кг.
Особые исходные хроматографические условия для NIV послужили поводом для исследовательских поисков. При объеме инжекции 100 μл с десятикратным разведением пробы были установлены намного лучшие показатели пределов количественного определения, чем при объеме прямой инъекции 25 μл или 50 μл с 1/5 разведением пробы. Ацетонитрил в пробе в конце процедуры экстракции вызвал расширение пика для NIV. Такой эффект может быть устранен путем 10-кратного разбавления пробы в 100% воде + 5 ммоль ацетата аммония.
Заметки
- Калибровочные кривые всех веществ значительно отличаются. Предел количественного определения и верхние границы линейного динамического диапазона всех выявленных микотоксинов представлены в [таблице 3].
- Показатели извлечения были определены для каждого микотоксина в каждой матрице в сравнении с калибровочными кривыми без матрицы [таблицы 4-6].
- Было установлено, что растворы экстрагированных зерен остаются стабильными в течение 36 часов в условиях холода (4 °C).
- Наблюдался большой перенос ОТА из предыдущей пробы при вводе высоких концентраций стандарта, ввиду этого были введены холостые пробы растворителя после инъекций стандартов.
- С июля 2007 года около 220 проб зерна было проанализировано при использовании представленного здесь валидированного метода.
- Представленные данные основаны на данных Европейской программы мониторинга зерна, выбранные данные представлены в [таблицах 4 и 6].
Заключение
Разработанный метод подходит для анализа 9 токсинов Fusarium (Фузариум) и ОТА за один рабочий цикл ЖХ-МС/МС без необходимости проведения времязатратной подготовки пробы / обогащения.
Предел количественного определения был установлен
для ОТА: 0,3 мкг/кг,
для НТ-2, Т-2 и ZON: 5 мкг/кг,
для AcDON, DON, FUS X, DAS и NIV: 10 мкг/кг.
Данные показатели соответствуют требованиям национальных и европейских постановлений, принятых в отношении пределов определения.Процентные показатели извлечения были определены в диапазоне: 21 – 100 %.
Источники
Данные из материала можно использовать только для использования в научно-технических целях. Не для использования при проведении диагностических процедур! Для диагностики in vitro.
Упомянутые в настоящем документе товарные знаки и/или зарегистрированные товарные знаки являются собственностью SCIEX Pte. Ltd. или соответствующих владельцев на территории Соединенных Штатов Америки и/или в иных странах. AB SCIEX™ используется в соответствии с лицензией. Авторское право 2010 DH Tech. Dev. Pte. Ltd.
Номер оригиальной публикации: 1121410-01