Особые способы рассматривать опухоль

Одновременно визуализировать на срезе ткани множество маркеров не под силу ни традиционной иммуногистохимии с использованием красителей, ни ИГХ с визуализацией при помощи антител с флуорофорами. Что же делать? Использовать современные высокотехнологичные решения! В их основе тоже лежит детекция флуоресцентного сигнала, однако система его генерации здесь устроена намного более хитроумно.

Картина мультиспектрального окрашивания иммунных клеток в опухолевой ткани щитовидной железы при помощи TSA. CD4 — маркер Т-хелперов; CD8 — маркер Т-киллеров; PD-1 — иммунологическая контрольная точка; PD-L1 — иммунологическая контрольная точка (лиганд для PD-1); Foxp3 — маркер регуляторных Т-клеток; CK — цитокератин. Таким образом удалось идентифицировать, какие именно Т-клетки экспонируют молекулы — иммунологические чекпоинты.

Вариант 1: тирамид-сигнальная амплификация

Тирамид-сигнальная амплификация (TSA) — метод, благодаря которому можно окрасить срез на восемь маркеров одновременно. Процедура предельно проста: это классическая ИГХ с чуть видоизмененными конечными этапами. В качестве вторичных — визуализирующих — антител используются антитела, меченные пероксидазой хрена, после чего добавляется конъюгат тирамида с флуорохромом. Тирамид — органическое вещество, которое в присутствии пероксидазы в силу ее ферментативной активности присоединяется к органическим молекулам вокруг (в данном случае к первичному, вторичному антителу и даже самому маркеру). Циклы окрашивания-детекции повторяются последовательно для каждого из маркеров. В результате системы на основе TSA в 10–100 раз чувствительнее стандартной флуоресцентной микроскопии и позволяют использовать первичные антитела одного видового происхождения, поскольку в этом случае нет перекрестных реакций. На этом принципе основано решение Akoya Phenoptics: комбинация наборов реагентов Opal, платформ Mantra и Vectra 3, а также программного обеспечения для корректного анализа получившихся изображений позволяет решать такие задачи, как оценка эффективности противоопухолевых лекарств по уменьшению количества опухолевых клеток или выделение субпопуляций опухолевых клеток по экспонированию того или иного маркера.

Принцип тирамид-сигнальной амплификации. Антиген последовательно инкубируется с первичными и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, после чего добавляется тирамид с флуоресцентной меткой. Этот комплекс ковалентно связывается с белковыми молекулами (антигеном и обоими антителами).

Вариант 2: баркоды с флуорохромами

Тирамид-сигнальная амплификация требует цикличного повторения окрашивания и детекции сигнала, поскольку для каждого антитела требуется новая порция реагента с тирамидом. Если же первичные антитела к каждому из маркеров сделать уникально детектируемыми, то окрашивание можно производить сразу на несколько маркеров одновременно. Так работает система Akoya Codex: срез ткани инкубируется с первичными антителами, каждое из которых несет на себе уникальный штрих-код — небольшую олигонуклеотидную последовательность (рис. 6, рис. 7). Далее эти антитела визуализируются не вторичными антителами, как это обычно бывает, а реагентом из комплементарного олигонуклеотида, меченого флуорофором. За один раз добавляют три таких реагента, спектры флуоресценции которых не пересекаются. Сигнал детектируется, реактивы удаляют — и цикл повторяется. Производители говорят, что таким образом можно окрасить ткань до 50 раз без потери качества.

Схема эксперимента при использовании системы Akoya Code. Шаг 1: Окрашивание антителами с пришитыми к ним олигонуклеотидами. Шаг 2: Визуализация сигнала при помощи флуорофоров, конъюгированных с олигонуклеотидами. Шаг 3: Отмывка флуорофоров. Шаг 4: Повторение окрашивания.

Эволюция иммуногистохимической визуализации: от хромогенного окрашивания к использованию флуорофоров, тирамин-сигнальной амплификации и баркодов. а — Стандартная ИГХ с хромогенным окрашиванием. б — ИГХ с флуоресцентным окрашиванием. в — ИГХ с использованием принципа TSA. г — ИГХ с использованием конъюгатов флуорофоров с олигонуклеотидами.

А узнать больше о классической иммуногистохимии и еще одном способе окрасить опухоль вы можете здесь: https://biomolecula.ru/articles/zhizn-i-sudba-vizualiziruem-kletochnyi-sostav-tkani