Иммуногистохимия и флуоресцентная микроскопия – лучик света в опухоли

Окрашивание четырех ассоциированных с Т-лимфоцитами маркеров в ткани карциномы из клеток Меркеля при помощи флуоресцентно меченных антител. CD8 — рецептор на поверхности Т-киллеров; CXCR3 — хемокин, экспонируемый в первую очередь на активированных Т-лимфоцитах; гранзим Б — важнейший белок, участвующий в процессе контактного цитолиза. По этому изображению можно судить, что в опухолевой ткани есть Т-лимфоциты, способные уничтожить опухоль методом контактного цитолиза.

Один из основных методов оценки опухоли в клинической практике — иммуногистохимия(ИГХ), применяющийся уже 80 лет, начиная с 1941 года. Он позволяет визуализировать интересный нам белок, находящийся в опухолевой клетке или в клетке микроокружения. По получившемуся изображению можно судить об интенсивности его синтеза или о количестве интересующих нас клеток. Принцип ИГХ прост: кусочек опухолевой ткани тонко нарезают, срезы помещают на стекло и далее окрашивают антителами, специфичными к определенному белку-антигену. В результате под световым микроскопом клетки, несущие антиген, отличаются по цвету от тех, у кого он отсутствует. Важно, что на одном срезе в этом случае можно окрасить клетки только по одному маркеру-антигену. Но что же делать, если нужно рассмотреть несколько маркеров, причем одновременно?

Самое простое решение — взять несколько срезов, сделанных последовательно, и каждый из них покрасить своим антителом. Так, как правило, и делается в рутинной клинической практике. Понять взаимное расположение маркеров на таких пошаговых срезах легко, но, конечно, с допущением: надо помнить, что срез имеет толщину в несколько микрометров, и каждый последующий, соответственно, проходит по другим, хоть и соседним, клеткам.

Пример традиционного ИГХ-анализа опухолевой ткани щитовидной железы, в котором детектировали CD3 — маркер Т-лимфоцитов. В качестве красителя использовали DAB (диаминобензидин), поэтому Т-лимфоциты, находящиеся среди опухолевых клеток, окрашены в коричневый цвет. Рядом с ними неокрашенные — опухолевые — клетки, которые можно распознать по различным цитологическим особенностям и производству маркеров, которые также можно визуализировать при помощи ИГХ.

Второе возможное решение — одновременное окрашивание антителами с двумя разными хромогенами — соединениями, обусловливающими цвет получившегося окрашивания. Тогда на одном и том же срезе можно посмотреть выработку двух маркеров и корректно сравнить их между собой. Но, конечно, для полноценного анализа двумя маркерами не обойдешься.

И тут на помощь приходит флуоресцентная микроскопия! Почему бы не окрашивать срез сразу целым набором из нескольких антител с различными флуоресцентными метками? Тогда картины окрашивания каждого из них можно наложить друг на друга и увидеть «портреты» отдельных клеток по нескольким маркерам ! Кроме того, громадным преимуществом использования флуорофоров является чувствительность: для того, чтобы увидеть свечение, достаточно всего 50 сигналов на кубический микрометр!

К сожалению, даже флуоресцентная микроскопия бессильна перед сложными случаями, когда количество маркеров очень велико. Дело в том, что со временем флуоресцентный сигнал затухает, и бесконечно переключать лазеры для того, чтобы «подсвечивать» разные метки, не получится. Кроме того, спектры флуорофоров, в идеале, не должны перекрывать друг друга, чтобы картина, получившаяся при использовании одного, не интерферировала с другим. Это также ограничивает число меток. Поэтому, как правило, при стандартном флуоресцентном окрашивании детектируют лишь 3–4 маркера за эксперимент.

Окрашивание лимфоидной ткани антителами к CD3 (Т-лимфоциты, зеленый), CD19 (В-лимфоциты, красный) и IgD (фиолетовый). Сайт MACSima™ Art позволяет представить, как выглядит одновременное окрашивание различными антителами системы MICS.

А о других способах окрасить опухоль, вы можете узнать тут: https://biomolecula.ru/articles/zhizn-i-sudba-vizualiziruem-kletochnyi-sostav-tkani