В любом исследовании первый этап - это постановка целей и задач. Потом надо подумать, какой материал можно для этого использовать. И тут возникает вопрос, а собственно, какой материал пригоден для молекулярных исследований и как собрать свежий, чтобы не испортить? Я довольно часто слышала мнение от новичков в этой области, что материал надо собрать в 95% спирт и он должен быть свежий (этого года, например). Но это не совсем так.
Действительно, для большинства случаев в идеале материал надо сразу же замораживать морозильнике на -70 или -80С или ниже, например, в жидком азоте (-196С). Можно также помещать в 95-99% спирт и так же замораживать в морозильнике на -20С. Вот тут написано, что замораживать образцы в спирте на -80С нельзя (Anchordoquy & Molina 2007), но уже выделенную ДНК в буфере так хранят.
В реальности, все одновременно и проще, и сложнее. Проще, потому что ДНК разрушить сложнее, чем кажется, и не нужно соблюдать идеальные условия, чтобы из тканей что-то выделить. Даже из мамонта, который пролежал в земле тысячи лет, секвенируют количество ДНК, которое уже можно назвать геномом (van der Valk et al. 2022). Конечно, чем свежее материал, тем лучше. С другой стороны, при правильном хранении, ткани, собранные даже несколько десятилетий назад, могут быть пригодны для рутинной работы. Сложнее, потому что способы сбора и хранения могут быть разными, и зависят от группы организмов и тканей, с которыми вы работаете, и ваших условий работы. Я рекомендую вот этот обзор Nagy (2010), где описаны разные способы хранения ДНК, а также приведена таблица, где расписано, что подходит для каких групп организмов и тканей.
У меня нет целей писать обновленный обзор, я перечислю наиболее распространенные способы хранения ДНК, которые обычно используют для научных целей.
1) Как я уже написала, 95-99% спирт и замораживание на -20С. Подходит практически для всего. Никто не знает, сколько можно хранить образцы в таких условиях, чтобы они оставались пригодными для рутинной работы поскольку долгосрочных исследований на полвека нет. Скорее всего 10ки лет, возможно, даже сотни, если образцы не размораживать часто.
Однако есть и проблемы. Во-первых, если речь идет о больших животных (позвоночные), то для спирта нужны очень большие емкости. Хранить их в морозильнике фактически нереально. А при комнатной температуре ДНК даже в спирте разрушается довольно быстро. Не могу сказать насчет позвоночных, но для насекомых срок хранения примерно 8-10 лет, более старые образцы будут требовать модификаций протоколов для более деградированной ДНК. При этом спирт еще надо периодически менять и он огнеопасный, поэтому нужны специальные помещения. В качестве альтернативы, можно собирать небольшой кусочек тканей и хранить в спирту, остальное хранить отдельно другими способами. Что касается насекомых, то часто дупликаты собирают либо в 70% спирт, либо сухими, потому что в 95% спирте некоторые группы насекомых становятся очень ломкими и плохо подходят для определений и морфологических исследований (Marquina et al. 2021).
2) Спирт с меньшей концентрацией. Даже если вы собрали образцы в 70-90% спирт, это не означает, что все пропало. Если они свежие (до 5 лет, а то и больше), то из них тоже вполне можно успешно выделять ДНК, особенно, если вы их храните в морозилке на -20С (Marquina et al. 2021). Есть исследование, в котором показано, что можно выделить ДНК из образцов, которые десятки лет хранятся в спирте даже с меньшей концентрацией (60-65%), однако, конечно, больше усилий надо приложить, чтобы получить сиквенс, и длина прочтения будет меньше (Schiller et al. 2008).
3) Глубокое замораживание. Подходит для позвоночных, легче хранить, не надо возиться со спиртом. Если нет цели хранить образцы десятилетиями и ДНК будет выделяться в ближайшие годы, то температура -20С вполне подойдет. Однако не всегда это возможно сделать, особенно в полевых условиях.
4) Высушивание, желательно быстрое. Особенно подходит для мелких насекомых и растений (Bressan et al. 2014 - про растения). Для насекомых при правильном хранении (при прохладных температурах, в сухих условиях, без обработки химикатами) ДНК нормально можно выделить даже если экземпляру 30 лет. Может, при таком хранении и в более старых экземплярах ДНК не сильно деградирует, но я не пробовала. Мелкие насекомые высушиваются очень быстро сами по себе, особенно если сборы ведутся в жарких и сухих местах. Если экземпляры были собраны во влажных биотопах, например, в тропиках, или во время дождя, то они не высохнут до достаточного уровня, и ДНК будет быстрее деградировать. Способы высушивание образцов также приведены в статье Nagy (2010).
5) Другие жидкости, кроме этанола: глицерин, пропиленгликоль, ацетон, ЭДТА, CTAB... (Nagy 2010). Исследования на насекомых показывают, что пропиленгликоль может быть не хуже для сохранения тканей, и в некоторых случаях даже лучше. Пропиленгликоль не горючий материал и не такой летучий, поэтому может быть хорошей альтернативой для этанола, особенно если используется для ловушек или если надо транспортировать образцы в большом количестве самолетом (Nakamura et al. 2020). Ацетон также рекомендуется для насекомых (Nagy 2010). Для бактерий существуют свои растворы, рекомендованные для хранения (Mitchell & Takacs-Vesbach 2008, Gray et al. 2012).
6) Если вы работаете с кровью, то ее надо собирать желательно так, чтобы она не сворачивалась (Seutin et al. 1991). Особенно это важно, если выделение идет на колонках. Антикоагулянт, например, ЭДТА, обычно наносится на стенки пробирок, в которых берут кровь для анализов, и их можно заказать в специализированных магазинах. Также есть и другие способы сохранять ДНК в клетках крови (например, Gaaib et al. 2022, Zhou et al. 2022)
И еще три добавления к тому, что я уже написала. Во-первых, ДНК можно выделять даже из образцов, которые хранили не очень правильно или в условиях, которые не очень способствуют сохранению ДНК. Например, можно выделять ДНК из формалиновых образцов и из образцов, фиксированных в канадском бальзаме, из сухих коллекционных материалов, которые хранились просто в шкафу с нафталином и так далее. Это только означает, что придется больше времени и денег затратить на выделение, для ПЦР надо будет заказать более дорогую полимеразу, возможно, полученный фрагмент ДНК будет меньше, и скорее всего не для всех образцов что-то получится сделать. Про некоторые техники работы с более деградированной ДНК я напишу. Во-вторых, если вы выбрали какой-то способ хранения, то, желательно, его не менять. Например, сухие образцы нельзя помещать в спирт, и наоборот спиртовые образцы нельзя высушивать. Концентрацию спирта лучше не менять. Замороженные образцы желательно как можно меньше размораживать. Наверное, какие-то способы хранения можно замещать другими через какое-то время, но лучше знать наверняка, что так можно. Если нет возможности узнать, тогда осознанно пойти на риск и для начала провести эксперимент на менее ценном материале. В-третьих, надо узнать заранее, какое хранение образцов подходит для методов, которые вы хотите применять. Например, если ваша задача просто делать баркодинг, то для этого можно использовать широкий спектр методов сбора и хранения. Если вы хотите делать мультигенные исследования и среди списка маркеров есть ядерные, то, конечно, лучше, чтобы как можно больше материала было высокого качества. Для геномных исследований важны способ секвенирования, цели исследования и анализ данных. Для некоторых случаев можно будет использовать только образцы хорошего качества, для других подойдут и древние экземпляры.
Anchordoquy, T. J., & Molina, M. C. (2007). Preservation кDNA. Cell Preservation Technology, 5(4), 180-188.
Bressan, E. A., Rossi, M. L., Gerald, L. T., & Figueira, A. (2014). Extraction of high-quality DNA from ethanol-preserved tropical plant tissues. BMC research Notes, 7(1), 1-6.
Gaaib, J. N., Juda, Z. W., & Aedan, R. H. (2022). A comparison of human blood preservation methods in DNA extraction protocol. Advancements in Life Sciences, 9(1), 122-125.
Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., & Łukasik, P. (2021). The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ, 9, e10799.
Michael A, G., Zoe A, P., & Christina A, K. (2013). Comparison of DNA preservation methods for environmental bacterial community samples. FEMS microbiology ecology, 83(2), 468-477.
Mitchell, K. R., & Takacs-Vesbach, C. D. (2008). A comparison of methods for total community DNA preservation and extraction from various thermal environments. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 35(10), 1139-1147.
Nagy, Z. T. (2010). A hands-on overview of tissue preservation methods for molecular genetic analyses. Organisms Diversity & Evolution, 10(1), 91-105.
Nakamura, S., Tamura, S., Taki, H., & Shoda‐Kagaya, E. (2020). Propylene glycol: a promising preservative for insects, comparable to ethanol, from trapping to DNA analysis. Entomologia Experimentalis et Applicata, 168(2), 158-165.
Schiller, E. K., Haring, E., Däubl, B., Gaub, L., Szeiler, S., & Sattmann, H. (2014). Ethanol concentration and sample preservation considering diverse storage parameters: a survey of invertebrate wet collections of the Natural History Museum Vienna. Annalen des Naturhistorischen Museums in Wien. Serie B für Botanik und Zoologie, 41-68.
Seutin, G., White, B. N., & Boag, P. T. (1991). Preservation of avian blood and tissue samples for DNA analyses. Canadian journal of zoology, 69(1), 82-90.
van der Valk, T., Dehasque, M., Chacón-Duque, J. C., Oskolkov, N., Vartanyan, S., Heintzman, P. D., ... & Dalén, L. (2022). Evolutionary consequences of genomic deletions and insertions in the woolly mammoth genome. Iscience, 25(8), 104826.
Zhou, L., Lei, Q., Guo, J., Gao, Y., Shi, J., Yu, H., ... & Zhu, W. (2022). Long-term whole blood DNA preservation by cost-efficient cryosilicification. Nature Communications, 13(1), 6265.