Выделение ДНК - процесс простой. В интернете много видео, на которых выделяют ДНК из банана или полкило клубники с помощью мыла и спирта. Например, https://www.google.com/search?q=how+to+extract+dna&oq=how+to+extract+dna&aqs=chrome..69i57j0i512l9.5036j0j7&sourceid=chrome&ie=UTF-8#kpvalbx=_eePSY77dGI3NrgSzs72gBQ_41
Однако не всегда у нас есть столько материала для выделения, к тому же, ДНК должна быть высокой степени очистки для дальнейшей работы. Подручных средств для этого будет мало. И в этом случае, все уже не так просто. Способов выделения ДНК очень много. Методология зависит от группы организмов, свежести и способа хранения материала, задач исследования, финансовых возможностей. Более того, многие модифицируют стандартные протоколы под свой случаи. Чтобы охватить все способы и тонкости выделения ДНК, надо будет написать целую книгу.
Во многих случаях, выделение ДНК включает лизис клеточных стенок с помощью детергентов (обычно эти буферы пенятся), затем отделение белков от ДНК, и потом дополнительная очистка с помощью спирта или спиртовых буферов. Хранят ДНК обычно в дистиллированной воде или в специальных буферах (видимо, тоже на водной основе).
В самом простом случае вам понадобятся следующие приборы: водяная баня или сухой термостат, центрифуга, вортекс. Все это можно купить на сайтах, специализирующихся на оснащении лабораторий.
Для примера я покажу, как эти приборы выглядят, но фирму можно выбрать любую. Это не супер сложное оборудование и его производят много фирм.
Термостат с отверстиями для пробирок на 1.5-2 мл.
Также можно купить лабораторную водяную баню, но к ней нужна какая-то подставка для пробирок на 1.5-2 мл, чтобы пробирки плавали в воде крышкой кверху. Ее можно самим сделать из пенопласта или другого легкого материала.
Вортекс (миницентрифуга). Желательно сразу же покупать миницентрифугу с насадками для пробикрок 1.5 или 2 мл (для них одинаковые отверстия) и для пробирок на 0.2 мл, они пригодятся для приготовления проб к ПЦР.
Центрифуга нужна высокоскоростная, желательно до 14500-15000 оборотов в минуту. Есть много центрифуг с охлаждением, и они, разумеется, стоят и весят больше, и занимают больше места. Но в простых случаях охлаждение не обязательно.
Также вам понадобятся механические дозаторы для наконечников до 1000 мкл, до 200 мкл и до 20 мкл. Сами наконечники соответствующих размеров, ну и, разумеется, пробирки на 1.5 или 2 мкл. Работать всегда рекомендуется в лабораторных перчатках и почаще их менять.
В этой статье я сконцентрируюсь на том, что я знаю относительно своих объектов. Я занимаюсь мелкими насекомыми, клопами-слепняками, обычно они не более 1 см длиной, и чаще всего меньше. Я выделяю ДНК как из спиртовых сборов, так и из сухих, и чаще всего, если материал свежий (до 5 лет), то разница не особенно чувствуется. У клопов мы обычно выделяем ДНК из брюшка. У этой группы это возможно, потому что у них не очень много симбионтов. Я знаю, что у более крупных насекомых, например, бабочек или прямокрылых, чаще выделяют ДНК из ноги. А вот у термитов, тоже мелких насекомых, стараются выделять ДНК из голов, потому что у них ноги тоже мелкие, а в брюшках много симбионтов. Однако это не так просто, потому что головы у них сильно склеротизованные, и надо использовать отдельное оборудование, что раскрошить ткани. В таком случае в пробирку с головой помещают магнитный шарик, и крутят на магнитной центрифуге.
У клопов тоже можно раскрошить брюшки, и иногда это делают, но тут достаточно стерильного пропиленового пестика, который помещается в пробирку, где уже находится лизисный буфер и те ткани, из которых вы собираетесь выделять ДНК.
После использования пестика, его можно помыть в перекиси, проавтоклавировать и использовать заново.
Я не крошу брюшки, потому что нам нужны генитальные структуры, чтобы потом можно было подтвердить определение до вида с помощью них. Особенно это важно в случае работы с группами с запутанной таксономией. В принципе, это не особо влияет на результат.
Легче всего выделять ДНК на колонках с помощью уже готовых наборов для выделения (extraction kit). Они включают готовые реагенты, которые разлиты по баночкам и подписаны, и протокол, который либо прилагается к набору, либо доступен онлайн. Такие наборы обычно хранят на полке несколько лет (иногда какие-то реагенты надо положить в холодильник или морозильник).
Таких наборов очень много. Среди самых распространенных и знаменитых, подходящих для разных организмов и типов тканей - это Qiagen Blood & Tissue Kit. У него относительно короткий и простой протокол, причем этот набор подходит даже для выделения ДНК из относительно старых образцов, где мало ДНК.
Для насекомых я модифицирую стандартный протокол. 1) Оставляю в термостате или водяной бане ткани в лизисном растворе на ночь, чтобы хитиновые оболочки получше растворились. 2) После добавления последнего спиртового буфера (AW2), я кручу пробирки на центрифуге дважды. Первый раз на самой высокой скорости (как рекомендуется в протоколе). Второй раз на скорости, которую рекомендуют для первого спиртового буфера (AW1). Это я делаю для того, чтобы по возможности весь спиртовой буфер ушел на дно пробирки. Я заметила, что очень часто некоторое количество спиртового буфера все же остается и смешивается с последним буфером AE (в котором надо хранить ДНК), Это больше разбавляет ДНК, что уже плохо, и к тому буфер AW2 не предназначен для ее хранения. 3) Добавляю меньше буфера AE. В протоколе рекомендуетcя 200 мкл, я добавляю для свежих образцов 100 мкл (для спиртовых до 5-7 лет, сухих до 3-5 лет), для более старых образцов я добавляю 50 мкл буфера (спиртовые 5-10 лет, сухие 3-7 лет), ну и для самых старых я добавляю 25 мкл буфера AE. Как я уже написала ранее, сложно заранее сказать, из экземпляра какого возраста можно что-то получить, а из какого - нет. Очень многое зависит от способа хранения. Если экземпляр важный для вашего исследования и ему более 10 лет, то стоит все равно попытаться. У меня получается успешно выделять ДНК из образцов, которые были собраны более 20 лет назад (но, конечно, далеко не из всех).
У Qiagen также есть другие наборы для выделения, более специализированные. Например, Qiagen Investigator Kit. Который, вроде как, подходит для малых концентраций ДНК, но я пробовала его, и не заметила особенной разницы для насекомых. Только протокол длиннее, и цена у него выше.
Сейчас я перешла на наборы Евроген ExtractDNA Blood & Cells , просто потому что они дешевле и их легче купить. Мне говорили, что качество наборов Евроген не такое хорошее. Про своих клопов могу сказать, что ДНК все же у них выделяется, но про разницу в качестве пока сказать не могу, мало материала для сравнения. Но протоколы у них длиннее.
Из наборов, которые подходят для широкого спектра организмов, еще часто хвалят Thermofisher GeneJET Genomic DNA Purification Kit, и другие наборы Thermofisher, но я сама ими никогда не выделяла.