Для проведения различных манипуляций с ДНК необходимо получить эту самую ДНК. Для большинства случаев достаточно иметь несколько миллилитров раствора, содержащего ДНК, но есть проблема: как получить эти несколько миллилитров? Раньше для этого применяли сложные методы выращивания микробов. Например, болеет человек, приходит ко врачу, у него берут мазок. В мазке содержатся бактерии, их помещают на питательную среду, несколько дней культивируют, затем клетки разрушают (лизируют), после чего получают раствор ДНК, однако ДНК в клетке не так то много, поэтому необходимо концентрирование, а еще нужна очистка от клеточных остатков. Короче говоря, все эти процедуры требуют больших затрат времени и средств, поэтому была разработана более простая и изящная методика - это ПЦР (полимеразная цепная реакция).
Какие ограничения?
С помощью ПЦР можно получить миллионы копий ДНК даже из 1 исходной молекулы. Однако, у метода есть некоторое ограничение, например, провести ПЦР можно только для фрагментов длиной не более 3000 пар нуклеотидов.
Что нужно для проведения?
Итак, что нам нужно: 1. Два синтетических олигонуклеотидных праймера (получены путем химического синтеза, ~20 нуклеотидов каждый), которые комплементарны областям на противоположных цепях, окружающих мишень. 2. ДНК, которую нужно амплифицировать (размножить). 3. термостабильная ДНК-полимераза, активная после многократного нагревания до 95°С. Это фермент, который копирует ДНК-матрицу с высокой точностью. 3. Четыре дезоксирибонуклеотида (это аденин, тимин, гуанин, цитозин).
Как происходит процесс?
1. Денатурация. Первым этапом является термическая денатурация двухцепочечной ДНК, это достигается повышением температуры реакционной смеси до 95°С. Реакционная смесь состоит из исходной ДНК, избытка олигонуклеотидных праймеров, термостабильной ДНК-полимеразы (например, ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерии Thermus aquaticus) и четырех дезоксирибонуклеотидов.
2. Отжиг. На втором этапе температура смеси медленно снижается. Праймеры образуют водородные связи с комплементарными нуклеотидами ДНК-мишени. Типичные температуры отжига находятся в диапазоне от 45 до 68°C. Зачем нужны праймеры? ДНК-полимераза не может начать синтез с пустого места, поэтому ей нужны "затравки", это своего рода "посадочные площадки", на которых фермент может зафиксироваться и начать синтез.
3. Амплификация. На третьем этапе температура повышается до ∼70°C, что является оптимальным для каталитической активности ДНК-полимеразы Taq, которая подставляет новые нуклеотиды комплементарно уже имеющимся, достраивая таким образом цепь.
После того как получены новые двухцепочечные ДНК, цикл повторяется столько раз, сколько это требуется.
Где это все происходит?
Процесс осуществляется в амплификаторе (см. картинку).
Это такое небольшое устройство, которое производит процесс в автоматическом режиме, исследователю нужно всего лишь внести нужные компоненты, задать режим и все.
Сколько времени занимает процесс?
Один цикл амплификации длится не более 2 минут, а через 30 циклов количество молекул в смеси будет в миллион раз больше, чем в начальный момент времени. То есть за час можно получить достаточное количество ДНК для дальнейших исследований.
