Во всем мире почти 70 миллионов человек страдают бесплодием. По данным Всемирной организации здравоохранения 9% пар во всем мире не могут зачать ребенка и до 50% случаев бесплодия связаны с мужскими факторами. Несмотря на успехи в понимании причин мужского бесплодие, идиопатическое бесплодие по-прежнему составляет около 30–50% проблем мужского бесплодия. Выявлено множество причин мужского бесплодия, которые можно разделить на претестикулярные, тестикулярные и посттестикулярные с врожденными, приобретенными или идиопатическими факторами. Во многих основных факторах, таких как образ жизни, инфекции, варикоцеле, радиация или загрязнение окружающей среды, участвует окислительный стресс, который в конечном итоге вызывает фрагментацию ДНК сперматозоидов.
Окислительный стресс вызывается дисбалансом между активными формами кислорода (АФК) и антиоксидантами. В нормальных условиях АФК и антиоксиданты находятся в равновесии; антиоксиданты нейтрализуют чрезмерное количество этих высокореактивных свободных радикалов и поддерживают гомеостаз. При патологических состояниях, когда концентрации АФК выше, чем антиоксидантов, возникает окислительный стресс, опосредованный АФК. Мужские половые клетки очень восприимчивы к перекисному окислению липидов Окислительный стресс считается основной причиной ДНК-фрагментации сперматозоидов.
Недавно внедренный метод выявления окислительного стресса заключается в измерении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП). Было показано, что этот метод является быстрым, простым, надежным и экономичным. Кроме того ряд авторов показали значимую положительную связь между ДНК-фрагментацией и окислительно-восстановительным потенциалом.
В отличие от методов определения ДНК-фрагментации, измерение ОВП является простым и быстрым, но еще не оценивалось для прогнозирования потенциала мужской фертильности в условиях вспомогательной репродукции.
Вопрос исследования: имеет ли окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) клиническое значение на репродуктивные исходы?
Целью данного проспективного исследования было изучение прогностических возможностей ОВП в отношении репродуктивных исходов (оплодотворение, развитие бластоцисты, клиническая беременность и живорождение) у пациентов, проходящих циклы ИКСИ, и сравнение их с прогностическим потенциалом стандартного флуоресцентного анализа ДНК-фрагментации.
Дизайн: проспективное обсервационное исследование, включающее в общей сложности 144 пары. В исследование были включены пациенты, прошедшие циклы ИКСИ. Были включены пары с необъяснимым бесплодием и необъяснимым мужским бесплодием, исключены пары с азооспермией. Определяли анализ спермы, семенной окислительно-восстановительный потенциал, определенный с помощью системы MiOXSYS, фрагментацию ДНК сперматозоидов (ФДС) и репродуктивные исходы (оплодотворение, развитие бластоцисты, клиническую беременность и живорождение).
Кратко главное в данной работе
Результаты:
Окислительно-восстановительный потенциал семенной жидкости достоверно отрицательно коррелировал
- со скоростью оплодотворения (r = –0,267; P = 0,0012),
- скоростью развития бластоцисты (r = –0,432; P <0,0001),
- имплантацией/клинической беременностью (r = –0,305; P = 0,0003)
- живорождением (r = –0,366; P <0,0001).
Анализ кривой рабочих характеристик показал значительную прогностическую способность окислительно-восстановительного потенциала для оплодотворения, скорости развития бластоцисты (≥60%; AUC 0,794; P <0,0001), имплантации/ клинической беременности (AUC 0,680; P = 0,0002) и живорождения (AUC 0,728; P < 0,0001).
Сопоставимые результаты были получены для ДНК-фрагментации (оплодотворение: AUC 0,678; развитие бластоцисты: AUC 0,777; имплантация/клиническая беременность: AUC 0,665; живорождение: AUC 0,723).
Нормальная морфология сперматозоидов показала самую низкую прогностическую способность для всех параметров репродуктивного исхода. При старшем возрасте мужчины в качестве вмешивающегося фактора, окислительно-восстановительный потенциал (пороговое значение 0,51 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл) оказывает значительное (P <0,04667) влияние на отношение шансов для всех параметров репродуктивных исходов.
Вывод: окислительно-восстановительный потенциал важен для оплодотворения, развития бластоцисты, имплантации, клинической беременности и живорождения.
Результаты и обсуждения подробно:
Сводная статистика возраста пациентов, параметров спермы (концентрация сперматозоидов, общая подвижность и нормальная морфология сперматозоидов), ДНК-фрагментации и ОВП наряду с оплодотворением и темпами развития бластоцисты представлены в ТАБЛИЦЕ 1.
В ТАБЛИЦЕ 2 сравниваются средние значения ОВП и ДНК-фрагментации сперматозоидов в случаях, когда не было оплодотворения, образования бластоцисты, имплантации/клинической беременности или живорождения, соответственно, с таковыми у пациентов с оплодотворением, образованием бластоцисты, имплантацией, клинической беременностью и живорождением.
Все сравнения, кроме ОВП (оплодотворение: P = 0,6924 и развитие бластоцисты: P = 0,0964) и ДНК-фрагментации (оплодотворение: P = 0,0914 и развитие бластоцисты: P = 0,2109), показали значительные различия
В ТАБЛИЦЕ 3 представлены средние значения окислительно-восстановительного потенциала и ДНК-фрагментации для случаев без оплодотворения и при отсутствии образования бластоцисты по сравнению с теми случаями, когда частота оплодотворения и образования бластоцисты были ≥80% и ≥60% соответственно. В то время как различий между группами не было обнаружено для окислительно-восстановительного потенциала (коэффициент оплодотворения P = 0,9593; скорость образования бластоцист P = 0,0847), различия для ДНК-фрагментации были значительными (коэффициент оплодотворения P = 0,0188; скорость образования бластоцист P = 0,0346).
Корреляции между параметрами эякулята, проанализированными в этом исследовании, показаны в ТАБЛИЦЕ 4.
Как и ожидалось, были обнаружены значительные положительные корреляции между концентрацией сперматозоидов и их подвижностью (r = 0,522; P <0,0001) и нормальной морфологией (r = 0,466; P <0,0001), а также между нормальной морфологией и подвижностью (r = 0,496; P <0,0001). Были также очень значимые положительные корреляции между процентом TUNEL-положительных сперматозоидов и окислительно-восстановительным потенциалом (r = 0,665; P <0,0001) с возрастом мужчины (r = 0,328; Р = 0,0001). Были обнаружены значимые отрицательные корреляции между возрастом мужчин и концентрацией сперматозоидов (r = –0,215; P = 0,0097), нормальной морфологией (r = –0,252; P = 0,0023) и подвижностью (r = –0,271; P = 0,0010), между концентрацией сперматозоидов и ОВП (r = –0,678; P <0,0001) и процентом TUNEL-положительных сперматозоидов (r = –0,467; P < 0,0001), между ОВП и подвижностью (r = –0,424; P <0,0001) и нормальной морфологией (r = –0,472; P <0,0001), а также между процентом TUNEL-позитивных сперматозоидов и нормальной морфологией (r = -0,415; P < 0,0001) и подвижностью (r = -0,428; P < 0,0001).
Сообщается о корреляции между мужским возрастом, стандартными параметрами спермы, расширенным тестом функции спермы (ОВП и ДНК-фрагментацией) и репродуктивными исходами (скорость оплодотворения, скорость развития бластоцисты, имплантация / клиническая беременность и живорождение) у пациентов, проходящих лечение ИКСИ.
в ТАБЛИЦЕ 5. В текущем исследовании все параметры вспомогательной репродукции (оплодотворение, развитие бластоцисты, имплантация/клиническая беременность и живорождение) значимо отрицательно коррелировали с окислительно-восстановительным потенциалом (r = –0,267, P = 0,0012; r = –0,432, P <0,0001; r = –0,305, P = 0,0003 и r = –0,366, P <0,0001 соответственно). Точно так же процент TUNEL-положительных сперматозоидов был значительно отрицательно связан с этими параметрами (оплодотворение: r = -0,341, Р <0,0001; развитие бластоцисты: г = –0,450, Р < 0,0001; имплантация/клиническая беременность: r = –0,280, P = 0,0010; живорождение: r = –0,347, P < 0,0001 соответственно). В то время как мужской возраст не коррелировал со скоростью оплодотворения, слабые, но значимые отрицательные ассоциации наблюдались для скорости развития бластоцисты (r = -0,198; P = 0,0215), имплантации/клинической беременности (r = -0,239; P =0,0055) и живорождения (r = –0,186; Р = 0,0312).
Анализ кривой для окислительно-восстановительного потенциала, процента TUNEL-положительных сперматозоидов и нормальной морфологии сперматозоидов был проведен для оценки прогностической способности ОВП, ДНК-фрагментации и нормальной морфологии в отношении оплодотворения (≥80%) (РИСУНОК 2A) и скорости развития бластоцисты (≥60%) (РИСУНОК 2B), имплантации/клинической беременности (РИСУНОК 2C), а также живорождения (РИСУНОК 2D) после ИКСИ.
Расчеты были значимыми (диапазон значений P: от P = 0,0420 до P <0,0001) по всем параметрам (ОВП, процент TUNEL-положительных сперматозоидов и нормальной морфологии) по всем конечным точкам (частота оплодотворения и развития бластоцисты, имплантация/клиническая беременность и живорождение), за исключением прогноза оплодотворения при нормальной морфологии сперматозоидов (AUC 0,572, P = 0,1320) ( ТАБЛИЦЫ 6–9).
Более того, в то время как прогностическая сила для трех протестированных параметров была значительно ниже 70% для оплодотворения и имплантации/клинической беременности, она была значительно выше 70% для окислительно-восстановительного потенциала и процента TUNEL-положительных сперматозоидов для развития бластоцисты и живорождения. Для нормальной морфологии предсказательная сила была самой высокой, около 70% для развития бластоцисты. Соответствующие расчетные пороговые значения для окислительно-восстановительного потенциала, предсказывающие хорошее оплодотворение (> 80%), образование бластоцисты (> 60%), имплантацию/клиническая беременность и живорождение были ≤0,709, ≤0,530, ≤0,465 и ≤0,393 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл соответственно при среднем значении 0,51 мВ/10 в 6 ст сперматозоидов/мл (ТАБЛИЦЫ 6–9).
Логистическая регрессия с оплодотворением, развитием бластоцисты, имплантацией, клинической беременностью и живорождением в качестве зависимых параметров и высоким/низким окислительно-восстановительным потенциалом (≤0,51 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл), первичным и вторичным бесплодием, необъяснимое бесплодие, поликистоз яичников, эндометриоз, трубный фактор, миомэктомия, недостаточность яичников и пожилой возраст матери как независимые переменные показали полное соответствие модели (P <0,0002) со значительным (P <0,0130) влиянием окислительно-восстановительного потенциала на все параметры репродуктивного исхода.
Расчет отношения шансов с использованием точки отсечения для нормального окислительно-восстановительного потенциала ≤0,51 мВ/10 в 6 ст сперматозоидов/мл, полученного в этом исследовании, и различных репродуктивных исходов (оплодотворение, развитие бластоцисты, имплантация/клиническая беременность и живорождение) приводили к значительно более высоким шансам для пациентов достичь оплодотворения ≥80% (ОШ 0,4651; 95% ДИ 0,2385–0,9070; P = 0,0247), развития бластоцисты ≥60% (ОШ 0,1287; 95% ДИ 0,0517–0,3203; P <0,0001), имплантации/клинической беременности (ОШ 0,3163; 95% ДИ 0,1535–0,6517; Р = 0,0018) и живорождения (ОШ 0,2299; 95% ДИ 0,1005–0,5260; Р = 0,0005), если окислительно-восстановительный потенциал был низким, т.е. ≤0,51 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл (табл. 10).
Если брать ранее опубликованное пороговое значение 1,34 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл, результаты были значимы только для оплодотворения и развития бластоцисты, но не для клинической беременности и живорождения (данные не показаны).
Аналогичная тенденция наблюдалась в отношениях шансов, когда возраст мужчин принимался во внимание в качестве искажающего фактора (ТАБЛИЦА 11).
Также было очевидно, что мужчины старшего возраста (≥37 лет) с высоким значением окислительно-восстановительным потенциала эякулята (>0,51 мВ/106 сперматозоидов/мл) имеют не только более низкую вероятность оплодотворения ооцитов, но и более низкую вероятность хорошего (≥60%) развития бластоцисты. Следовательно, это приведет к более низкой вероятности имплантации / клинической беременности и живорождения, чем у мужчин с низким значением окислительно-восстановительного потенциала или у молодых мужчин. В целом, молодые мужчины имеют более высокие шансы на успешный репродуктивный исход.
ОБСУЖДЕНИЕ
Хотя ВОЗ стандартизировала процедуры обычного стандартного анализа спермы (World Health Organization, 2010), она не может предсказать мужскую фертильность и оплодотворяющий потенциал сперматозоидов. Обычные параметры спермы обеспечивают лишь ограниченный прогноз адекватной функции сперматозоидов и не позволяют определить причину бесплодия примерно в 30–50% случаев. Следовательно, эти случаи остаются идиопатическими или необъяснимыми и часто не получают необходимого лечения. Были разработаны дополнительные тесты функции сперматозоидов, включая тесты на повреждение ДНК сперматозоидов и окислительный стресс, т.е. тесты на ДНК-фрагментацию и Анализ оксидативного стресса сперматозоидов (ROS test).
В то время как клиническая ценность тестирования ДНК-фрагментации постепенно признается и рекомендуется, тесты на окислительный стресс по-прежнему считаются экспериментальными.
В исследованиях указывается, что ОВП значительно отрицательно коррелировал с концентрацией, подвижностью и нормальной морфологией сперматозоидов и значительно положительно — с возрастом мужчин и уровнем ДНК-фрагментации. В то время как первые ассоциации указывают на негативное влияние окислительного стресса на функции сперматозоидов, вторые ассоциации, хотя и слабые, соответствуют возрастному увеличению концентрации АФК. Тем не менее, логистическая регрессия показала, что ОВП не зависит от женских и других параметров спермы. Это не только объясняет значительную связь между возрастом мужчин и репродуктивными исходами, но и наблюдение, что у пожилых мужчин (≥37 лет) с высоким семенным окислительным стрессом (> 0,51 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл) меньше шансов, что их сперматозоиды приведут к успеху, чем у мужчин той же возрастной группы с низкими значениями ОВП семенной жидкости (≤0,51 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл). Это также означает, что антиоксидантное лечение или изменение образа жизни, приводящее к снижению окислительного стресса, может привести к увеличению оплодотворения и улучшению скорости развития бластоцисты.
Анализ кривых ROC для нормальной морфологии сперматозоидов, ДНК-фрагментации и ОВП был выполнен в этом исследовании для оценки оплодотворения, развития бластоцисты, имплантации/клинической беременности и живорождения. Все протестированные параметры спермы/спермы значительно предсказывали параметры репродуктивного исхода, включенные в это исследование с прогностической способностью между 61,4% (нормальная морфология для имплантации/клинической беременности) и 79,4% (ОВП для хорошего развития бластоцисты). Примечательно, что нормальная морфология сперматозоидов показала наихудшую прогностическую способность.
Возможно, это связано с тем, что в этом исследовании всем пациентам проводилось ИКСИ, где осуществляется отбор наилучших по морфологическим признакам жизнеспособных сперматозоидов для инъекций.
Во многих исследованиях, пытающихся оценить функциональные тесты сперматозоидов, оплодотворение используется как первичная репродуктивная конечная точка без дальнейшего изучения возможных побочных эффектов на раннее развитие эмбриона, имплантацию/клиническую беременность и живорождение. Однако, учитывая, что сперматозоиды с поврежденной ДНК все еще могут оплодотворять ооциты, это может быть не лучшим конечным показателем для оценки функциональной способности сперматозоидов. Кроме того, следует учитывать и то, что помимо оплодотворяющей способности сперматозоидов, бластуляция зависит от качества ооцита, а также от условий культивирования. При этом возникновение клинической беременности и живорождения зависит от переноса хорошего эмбриона, рецептивности эндометрия, а также таких переменных, как преэклампсия, системные заболевания или преждевременные роды. Исходя из этого, очевидно, что AUC и отношение шансов неуклонно уменьшались от оплодотворения до живорождения. Это хорошо видно по текущим результатам. Поэтому в этом исследовании использовались более поздние репродуктивные конечные точки.
Поскольку разницы между AUC для ОВП и ДНК-фрагментацией не наблюдалось, возникает вопрос, какой анализ может быть клинически наиболее подходящим. В этом исследовании была подтверждена связь между ДНК-фрагментацией и семенным окислительным стрессом, измеряемым как ОВП. Таким образом, оба теста дополняют друг друга. Однако при рассмотрении времени, труда и стоимости эти факторы, по-видимому, благоприятствуют определению ОВП. Как сообщалось ранее, анализ TUNEL является трудоемким. Наоборот, анализ ОВП занимает всего около 4 минут после разжижения. Таким образом, результат может быть обсужден с пациентом в тот же день вместе с возможными вариантами лечения.
Хотя это исследование ясно показывает влияние окислительного стресса на репродуктивный исход у более широкого круга пациентов мужского пола исследование имеет ограничения.
Во-первых, использование ИКСИ могло способствовать тому факту, что рассчитанное пороговое значение ОВП было ниже ранее опубликованных значений, поскольку такие функции сперматозоидов, как подвижность или акросомная реакция, не играли роли в процессе оплодотворения. Напротив, для ВМИ и оплодотворения методом ЭКО эти функции сперматозоидов играют важную роль, поскольку капацитация должна запускаться небольшим количеством ROS. Поэтому пороговое значение ОВП может отличаться для ВМИ или ЭКО.
Во-вторых, использование флуоресцентного микроскопического анализа TUNEL ограничивало количество оцениваемых сперматозоидов.
В-третьих, это исследование было проведено с использованием невыбранной когорты пациентов, у которых определяли ОВП и связывали с репродуктивными исходами.
Дальнейшие проспективные исследования должны подтвердить текущие результаты, чтобы увидеть, может ли ведение пациентов на основе результатов ОВП улучшить клинические исходы у пациентов с бесплодием.
В заключение, это первое исследование, показывающее влияние окислительно-восстановительного потенциала эякулята на оплодотворение, развитие бластоцисты, имплантацию/клиническую беременность и живорождение как параметр исхода репродуктивной функции со средним пороговым значением 0,51 мВ/10 в 6ст сперматозоидов/мл в программе ИКСИ.
Однако дальнейшая оценка, не только путем тщательного установления физиологического диапазона ОВП для нормальной функции сперматозоидов, но и путем проведения более крупных исследований, включая ЭКО и ВМИ, необходимо четко установить прогностические возможности ОВП в андрологической диагностике для вспомогательной репродукции. Раннее и надежное выявление окислительного стресса может помочь в дальнейшей персонализации лечения ВРТ у пациентов с мужским бесплодием и направлять к клиницистам. Такой подход может затем привести к увеличению количества успешных исходов лечения бесплодия или использованию менее инвазивных подходов. Однако на данном этапе также следует отметить, что измерение ОВП нельзя предлагать пациентам с тяжелой олигозооспермией или азооспермией.
На основании этих результатов можно сделать вывод, что ОВП является полезным параметром, который следует включать в оценку мужского бесплодия.