Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является одной из базовых техник, широко и рутинно применяемых в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных задачах. Классическая ПЦР требует высокой степени чистоты препаратов ДНК или РНК, поскольку различные примеси могут ингибировать действие полимеразы и делать невозможной амплификацию целевых продуктов даже при наличии соответствующей матрицы.
Прямая ПЦР является модификацией классического метода, в котором отсутствует этап выделения и очистки препаратов нуклеиновых кислот. В качестве образца используется неочищенный лизат тканей. Образцы крови добавляются напрямую в реакционную смесь для ПЦР, минуя отдельную стадию лизиса. Исключение этапа выделения приводит к уменьшению времени анализа, а также снижает вероятность контаминации и ложноотрицательных результатов (вследствие утраты во время очистки образцов, содержащих малые количества целевых нуклеиновых кислот).
Мы предлагаем линейку наборов для прямой ПЦР производства Vazyme (Китай):
- One Step Mouse Genotyping Kit PD101 – для быстрого генотипирования мышей;
- One Step U+ Probe Mouse Genotyping Kit PD104 – для быстрого генотипирования мышей, содержит dUTP и UDG (урацил-ДНК-гликозилаза) для уменьшения вероятности контаминации;
- Plant Direct PCR Kit PD105 – для высокопроизводительного скрининга растений, не содержащих высокие концентрации полисахаридов или полифенолов;
- Blood Direct PCR Kit V2 PD103 – для анализа образцов крови млекоплетающих и других позвоночных животных.
Наборы (за исключением последнего) содержат один или два буфера для лизиса. Лизис происходит в течение 10-20 минут в присутствии протеиназы К (инактивируется нагреванием до 95°С в течение пяти минут). Сразу после этого лизат можно использовать для проведения ПЦР, либо хранить при -20 °С в течение трех месяцев.
Лизат вносится в реакционную смесь (мастермикс), которая содержит все необходимые компоненты для проведения ПЦР кроме праймеров. В состав мастермикса входят модифицированные полимеразы AceTaq DNA Polymerase либо Phanta Blood Super-Fidelity DNA Polymerase, которые работают по принципу горячего старта – ферменты неактивны при низких температурах, и для восстановления полимеразной активности требуется высокотемпературная активация (95 °С и 98 °С, соответственно в течение пяти минут). За счет горячего старта исключается накопление неспецифических продуктов ПЦР. Производитель гарантирует, что мастермиксы пригодны для постановки мультиплексных ПЦР – до четырех праймеров в одной реакции, т.е. два целевых продукта.