Вступление
Все мы знаем, кто такой К. Линней, он стал почти синонимом к слову систематика. Систематика Линнея основывалась на морфологических признаках, однако морфология штука загадочная и сложная, использование морфологии не может гарантировать достоверное систематизирование видов.
Другое дело - молекулярные данные, они ускоряют описание видов, а часто бывают единственной возможностью для исследователей дать какое-либо описание, что очень актуально для вымерших организмов.
Морфологическая систематика и ее недостатки
- Морфологическая идентификация основана на сравнительной анатомии, для этой работы нужен профессионал-анатом, а где его взять?
- На сравнение сложных образцов могут уйти годы.
- А если образцы повреждены? Что делать?
- Филогенетическая реконструкция – непростая задача даже для профессионала.
- Сколько профессионалов-анатомов, столько и мнений.
И здесь на помощь приходит молекулярная биология!
В настоящее время для идентификации и систематики видов используют молекулярные методы. При этом используются молекулярные маркеры, позволяющие обойти ограничения морфологических исследований.
Однако, только оценивая комплекс данных можно достоверно определить, к какому виду относится организм. Это называется «интегративная таксономия», в ней используются молекулярные, экологические, морфологические и поведенческие данные и довольно достоверно определяется видовая принадлежность организма.
Какие же маркеры используются для молекулярной систематики?
Маркеры представляют собой последовательности ДНК, по которым можно найти схожие участки у родственных видов. К таким маркерам относятся:
- микросателлитные локусы
- случайно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD)
- полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
- полиморфизм длины амплифицированных фрагментов
- экспрессированные теги последовательностей
- однонуклеотидные полиморфизмы
Эти маркеры различны в отношении их геномной распространенности, они широко используются для анализа генетического разнообразия, к тому же все маркеры можно исследовать одновременно.
Выбор маркеров обусловлен той проблемой, которую мы хотим решить, уровнем полиморфизма, технической оснащенностью исследователей и доступными методиками.
Митохондриальная ДНК как молекулярный маркер
Митохондрии являются ключевыми производителями энергии в эукариотических организмах, поэтому их справедливо называют «электростанцией клетки». Это небольшие цитоплазматические органеллы, окруженные двойной мембраной, которые, как полагают, произошли от прокариотических симбионтов (α-протеобактерий) в результате процесса, называемого эндосимбиозом.
Независимо от их происхождения, митохондрии сохранили свой собственный геном. Длина митохондриального генома практически не зависит от сложности организма. Их геном включает в себя структурные гены, кодирующие цитохром-с-оксидазы, НАДН-дегидрогеназы, рибосомные РНК и др. Но, также геном митохондрий включает некодирующую область, которая используется как надежный индикатор эволюционной истории.
Почему?
- Из митохондрий проще выделить ДНК, даже из мало сохранившихся образцов, особенно благодаря большому количеству копий самих органелл в клетке.
- Митохондриальные гены эволюционируют быстрее, чем ядерные гены (в 2-9 раз), по этой причине они считаются лучшими маркерами для анализа относительно близких меж-внутривидовых связей.
- Доступность универсальных праймеров (Праймеры получают химическим синтезом в амплификаторе, например, амидофосфитным методом).
Рибосомальные маркеры
Рибосомы – это органеллы, синтезирующие белок на матрице мРНК, они состоят из субъединиц, которые обозначаются, например,16S, 12S. При этом S – это коэффициент, говорящий о скорости седиментации, эти субъединицы выделяют с помощью осаждения, поэтому их так и назвали. Дак вот, 12S субъединица высококонсервативна и применима для понимания дивергенции на более высоких уровнях, например, в филах. А 16S применима на средних категориальных уровнях, например, в семействах или родах.
Маркеров так много, как их выбирают?
Выбор конкретной области гена, подходящей для конкретного анализа, неизбежно является наиболее важным шагом, поскольку выбор неподходящего генного маркера часто может привести к неправильной интерпретации. Важно учитывать ожидаемый уровень изменчивости при выборе молекулярного маркера, поскольку одни области могут изменяться быстрее по сравнению с другими. Но так или иначе, этот вопрос решается исследователями, исходя из их опыта и уже известных данных.
ДНК-штрихкодирование
Как обсуждалось ранее, морфологические методы идентификации видов могут быть сложными и отнимают много времени, поэтому была создана более быстрая и надежная система для надежной идентификации видов. Это система «Штрих-кода Жизни» (CBOL), целью которой было предоставление штрих-кода ДНК каждому виду на планете.
Штрих-код ДНК — это короткая стандартизированная последовательность ДНК в четко определенном гене, которую можно использовать для идентификации и классификации видов. Идеальный ДНК-штрих-код — это тот, который позволяет быстро, надежно, автоматически и экономично идентифицировать вид.
Как проводят идентификацию?
Путем сравнения неизвестных последовательностей со штрих-кодами ДНК известных видов.
Библиотека ДНК
В 2008 году было создано облачное хранилище и аналитическая платформа штрих-кодов жизни (iBOL, http://ibol.org), которая состоит из четырех основных модулей: образовательный портал, библиотека данных, реестр штрих-кодов (BIN, номера, присвоенные предполагаемым видам) и аналитическое хранилище.
С 2010 по 2015 год iBOL выполнила программу BARCODE 500K для создания справочной библиотеки штрих-кодов, определив последовательности для более чем полумиллиона видов.
BIOSCAN с 2019 года продолжает расширять библиотеку штрих-кодов, их цель – присвоить кодировку двум миллионам видов.
к 2026 г. BIOSCAN планирует стандартизировать методы отбора проб и секвенирования последовательностей ДНК организмов из всех мест обитания, что позволит заложить основы для глобально биомониторинга на основе ДНК.
Проблемы CBOL
Есть две основные проблемы:
1. Псевдогены
2. Использование области только одного участка
Псевдогены – это нефункциональные копии митохондриальных последовательностей, встроившиеся в ядерную ДНК. Митохондриальные гены могут быть перенесены в ядерную ДНК путем горизонтального переноса, транспозиции ДНК из митохондрий в ядро, переносом с помощью вирусных частиц, с последующей репликацией в ядре, что способствует репликации псевдогена. При этом, когда митохондриальная ДНК попадает в ядро, она теряет свою первоначальную функцию, в ней начинают быстрее накапливаться мутации, при этом ядерный геном подвергается мутациям медленнее, чем митохондриальный. Это создает значительные ограничения метода.
Использование области одного участка. Есть данные, что у двукрылых сложно различить представителей разных видов, а успех возможен менее чем в 70% случаев. Это происходит из-за совпадений областей, приписываемых внутри- и межвидовой изменчивости, по этим причинам CBOL разработала рекомендации использовать дополнительные области генов для более точного определения.
Итоги
Линней, конечно, красавчик, но мы и сами не пальцем деланные.