Содержание статьи:
На вебинаре 21 октября 2021 г. Диана Дроботова, ведущая направление по генотипированию в компании Thermo FS, рассказала о применении геномных технологий в животноводстве, рассмотрев проблемы и особенности селекции сельскохозяйственных пород и перспективы агрогеномики в ускорении селекционного процесса.
Роль геномных технологий в сельском хозяйстве
Действительно, новые технологии, о которых пойдет речь, активно внедряются на российский рынок не только в институты, но и в животноводческие хозяйства. Это общеевропейская и даже общемировая тенденция, и последние достижения науки незамедлительно проникают в практическую сферу.
Геномные технологии в животноводстве и растениеводстве помогают улучшить генофонд, получить животных или растения с улучшенными характеристиками, а также максимально снизить количество различных врожденных аномалий и мутаций.
Достижения в геномике позволяют улучшить и ускорить селекционные программы, позволяя сэкономить и расходы. и время на получение нового организма с улучшенным генофондом. Путь к целевому организму может быть сокращен на несколько лет, поскольку сразу после рождения животного или получения нового растения можно на основе генотипирования предсказать, какими характеристиками будет обладать этот организм, стоит с ним далее работать или нет. Теперь можно выбрать направленную селекционную концепцию и принимать эффективные селекционные решения. А главное – открывается возможность с помощью геномной оценки получать популяции с максимальной чистотой генов – с заданными признаками, но без генетических заболеваний.
Анализ рынка современных технологий показывает, что на 2021 г. рынок маркер-ассоциированной селекции составляет около 740 млн долларов (серый прямоугольник на диаграмме), а к 2026 г ожидается его рост в полтора раза. Ожидается рост в полтора раза и для рынка генотипирования. По другим родственным технологиям прогнозы отличаются не намного: показатели подтверждают, что все эти направления развиваются семимильными шагами.
Если говорить об области применения генотипирования или геномных технологий, следует отметить следующее.
Индекс племенной ценности – возможно, главный фактор в использовании геномных технологий. Происходит оценка животных или растений на ранних стадиях развития – почти сразу после рождения. При этом можно сделать выбор сорта или породы с лучшими характеристиками – теми, которые нужны для использования в конкретных программах селекции.
Выявление хозяйственно полезных признаков: зная какие маркеры связаны с определенными характеристиками организма, селекционер может выбирать животных с нужным цветом глаз, окраской меха, нужными показателями качества мяса, плодовитостью, фертильностью, конверсией корма, устойчивостью к болезням, климатическим условиям и лекарственным препаратам и т.д.
Получение животных без генетических заболеваний стало возможным потому, что теперь можно на ранних стадиях отсекать развитие животных или растений, у которых есть мутации, приводящие к генетическим аномалиям, даже не заметным визуально сразу после рождения.
Подтверждение происхождения – это основное направление работы многих лабораторий, производящих оценку чистопородности, доказательство происхождения, определение породы и популяции. Эти характеристики важны с экономической точки зрения, например, при закупках и продаже, в том числе в международной торговле, потому что оценка происхождения может обеспечить прослеживаемость принадлежности вплоть до страны происхождения или региона разведения либо выращивания организма.
Непосредственно селекционно-племенная работа – это научная часть работы в аграрном секторе, связанная с ведением направленного скрещивания. Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) позволяет найти новые маркеры, связанные с хозяйственно-племенными признаками, что важно опять же для расширения показателей индекса племенной ценности.
Научные основы технологии
Основа генотипирования, геномной селекции – единичные полиморфизмы. Известно, что от сотен тысяч до миллионов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP, «снипов») охватывают весь геном животного или растения. Часть из них связана с определенными признаками, с фенотипом.
Поиском новых SNP или валидацией уже открытых и занимается генотипирование.
Оно позволяет получить нужную информацию о генах и связанных с ними полиморфизмамах, проводить GWAS – так называемый поиск ассоциаций между полиморфизмами и фенотипом, и как следствие – вычислять индекс племенной ценности
Важно, что на первичном этапе работы по поиску этих маркеров и валидации маркеров, которые связаны с нужными качествами, очень важна плотность количества SNP, по которым генотипируют животных: чем больше SNP, тем точнее анализ.
Для чего это нужно?
В примере, связанном с генотипированием птиц, можно сказать, обобщая выводы и на другие организмы: необходимость чипа высокой плотности вызвана стремлением к максимальному охвату задач в области селекции (выявлению генетических ассоциаций со сложными признаками, тонному картированию локусов количественных признаков QTL, анализу генома для селекции, реализации геномного отбора GS по видам). Высокая плотность чипа расширяет применение технологии для различных видов и пород, позволяет шире охватить микрохромосомы, улучшает прогностическую эффективность геномных оценок с использованием генетического неравновесия по сцеплению (LD)
Есть такое понятие как генетическое неравновесие по сцеплению. Считается, что для полноценного GWAS – поиска ассоциаций полиморфизмов с признаками, то есть первичного этапа селекционной работы – требуется более 100 тысяч SNP. Если говорить о технологиях микрочипов – это чипы высокой плотности, необходимые, чтобы анализ и результаты были максимально точными.
Если говорить об определении родства и чистопородности, сейчас организациями общества ISAG рекомендованы STR – немного другой вид маркёров (микросателлитные повторы), на которых в настоящее время в основном сфокусирован генетический анализ для овец, крупного рогатого скота, кошек, собак, лошадей, в свиноводстве. Для их детекции требуется капиллярный электрофорез. Но тот же ISAG теперь настойчиво рекомендует переходить от STR к SNP – анализу единичных полиморфизмов, потому что они точнее и активно используются при решении тех же задач в сельском хозяйстве.
Между двумя этими подходами есть весьма сильное различие. Связано оно с простотой в интерпретации при использовании SNP (только две аллели: получаем результат как «гомозиготный А или В» или «гетерозиготный»). Высокопроизводительное генотипирование повышает точность: например, при анализе родства можно рассмотреть 200 SNP вместо 20 STR. И при поиске маркеров родства задействовано 500-800 «снипов».
В 2020-м вышло решение Евразийской экономической комиссии о том, что при осуществлении торговли животными внутри Евразийского экономического союза необходимо тестировать животных на определенные количество заболеваний, генетические аномалии, определяя STR. Но в этом же решении указаны SNP, которые служат альтернативой данной технологии. И в Российской Федерации SNP также официально включены в документы, эти маркеры можно исследовать в генетической экспертизе племенной продукции. Как видно на иллюстрации, в приложении приведены оба перечня – STR- и SNP-маркеров для проведения молекулярной генетической экспертизы с целью достоверности происхождения племенных животных.
История геномных технологий в продукции
ThermoFisher Scientific предлагает широкий спектр решений для любых задач. Независимо от того, какие задачи стоят перед потребителем – полногеномное секвенирование на первоначальном этапе, геномная селекция, маркерассоциированная селекция, определение родства или контроль качества – в зависимости от количества маркеров можно предложить те или иные современные подходы.
ThermoFS была пионером в технологии микрочипов. Сама эта технология была представлена рынку в США в середине 80-х компанией Affymetrix. Несмотря на то, что сейчас она вошла в состав ThermoFS, на российском рынке продукция Affymetrix недостаточно известна, что связано прежде всего с фокусировкой компании на американском рынке: у нее не было задачи глобализации. Однако с развитием технологии и спроса на соответствующие решения эту продукцию стали продвигать на европейском рынке примерно с 2010 года – конечно, существенно позже, но сейчас на этом рынке эта технология успешно внедряется. В России продвигать эту технологию начали только в 2021-м, и делает это команда по генотипированию, созданная в ThermoFS.
Микрочип или NGS?
Спектр возможностей современных геномных технологий на основе микрочипов действительно очень широк. Прежде всего следует разграничить области применения микрочипов и таргетного NGS. Выбор подхода зависит от количества маркеров.
На первом этапе геномной селекции, когда исследователь еще не знает, какие маркеры ему нужны и интересны, необходимо задействовать микрочипы. В это время ведется работа либо с неизвестными маркерами для поиска их связи, ассоциации с какими-либо признаками фенотипа, либо работа с известными маркерами и для скрининга животных или растений (например, неких местных пород или сортов). В любом случае первичная задача – это скрининг по максимальному количеству полиморфизмов, поэтому используются чипы высокой плотности.
Если перейти к количественным показателям, то граница пройдет так:
- от 5 тысяч до миллиона – микрочипы, технология Axiom;
- от 100 до 5000 маркеров – таргетное генотипирование с использованием NGS, технология AgriSeq.
Микрочипы Thermo Fisher Scientific
Микрочипы (ДНК-чипы) представляют собой плашку по размеру 96-луночного планшета, разбитую на лунки – ячейки с квадратиками. Каждая ячейка покрыта специальным фоточувствительным слоем, на который методом фотолитографии наносятся ДНК-зонды, комплементарные определенным участкам исследуемой ДНК, где находится искомые полиморфизмы. Эта ячейка состоит из миллионов одинаковых повторяющихся зондов. Например, если рассматривать чип высокой плотности, ячейку делят на сотни тысяч квадратиков размером 5 микрон на 5 микрон.
Другие технологии чипов, распространенные сейчас на рынке, имеют определенные ограничения.
Самый яркий пример – это технология с использованием микрочастиц. При производстве чипов у других производителей используется пул частиц. Зонды присоединяются к специальным частицам – шарикам, а затем, когда производится покрытие чипа, этот пул частиц наносится рандомным способом. Соответственно, часть этих частиц просто вылетает, не доходит до своих мест прикрепления лунок на чипе, и получается, что примерно от 5 до 20% маркеров на таких сторонних чипах теряется. Поэтому пользователь, который заказывает себе условные 50 тысяч маркеров, в реальности получает гораздо меньше ввиду ограничения технологии.
Это ограничение конкурентных технологий стало отправной точкой того, почему сейчас такую популярность получила в Европе технология Axiom, действительно обладающая определенными преимуществами.
Первое из них – всегда 100-процентный контент. При изготовлении чипов с контентом пользователь может быть уверенным, что если он заказал 800 тысяч маркеров, то он получит именно 800 тысяч маркеров – потерь маркеров не будет, ни о каких выпадениях в объеме 20% речь не идет. Это преимущество обеспечено технологией фотолитографии, когда синтез зонда идет под контролем в режиме реального времени: видно, в какой точке, в каком месте присоединяется тот или иной нуклеотид.
Это важно потому, что при первоначальном скрининге, где, по некоторым мнениям, допустима какая-то потеря маркеров и потому она не считается важной, но в дальнейшем она может сыграть свою роль. При переходе к индивидуальным пользовательским (кастомным) решениям, когда уже сделаны выводы о том, что по итогам скрининга выявлены важные в конкретной ситуации маркеры, потери не должно быть: это те самые маркеры, которые пользователь выбрал, и их потеря будет означать потерю места на чипе, а значит – увеличение стоимости анализа и тестирование образца по меньшему количеству маркеров.
Алгоритмы и возможности генотипирования
Thermo FS работает со сложными алгоритмами. По использованию программного обеспечения от Thermo существует отдельный тренинг, длящийся примерно час, но если говорить кратко – сам софт Thermo FS представляет собой мощный инструмент, позволяющий работать со сложными геномами и случаями, например, биаллельности, высокой доли GC оснований в составе, близкого расположения полиморфизмов, гомологии/псевдогенов и так далее.
Говоря о SNP т полиморфизмах, не следует забывать о других видах маркеров, таких как инсерции, делеции, вариации числа копий генов, которые в животноводстве также связаны с определенными признаками.
У команды биоинформатиков Thermo есть интересные исследования, в которых были найдены вариации числа CNV, связанные с крутизной рогов у животных. Этот маркер вызвал интерес у заводчиков, они обратили на него внимание.
Данные, полученные с использованием технологии Axiom, можно перевести в формат Long Format – то есть формат Illumina, чтобы сравнить данные, полученные на Axiom и Illumina.
Данные Axiom можно легко перевести в формат, позволяющий загрузить их в базу данных Совета по молочному скотоводству (CDCB).
Кроме того, у Thermo FS есть дополнительные пакеты, которые помогают автоматически анализировать диплоидные и полиплоидные виды – это особо актуально для растений. Вся эта работа проводится в автоматическом режиме.
Продолжение статьи на сайте.