2. Материалы и методы
2.1. Скрининг вазорелаксантного эффекта юглона в коронарных артериях свиней (Пкя)
Целью этих экспериментов было определение вазорелаксантного эффекта юглона в эндотелии интактных и оголенных Пкя.
2.1.1. Подготовка сегмента коронарной артерии
Свежие сердца у взрослых свиней обоего пола (~50 кг) были собраны из местных скотобоен и доставляют в лабораторию в ледяной Кребса-Henseleit решения 118 мм NaCl, 4,8 мм KCl, то 1.1 мм Мгсо4, 25 мм NaHCO3, 1,2 мм х2по4, 11.6 мм D-глюкозы и 1,25 мм комиссия2 ранее загазованность с карбогена (5% со2 и 95% О2). Затем левую коронарную артерию препарировали и помещали в раствор Кребса - Хензелайта. Затем ткани очищали от жировых и соединительных тканей и кольцевых сегментов (длиной 4 мм), суспендированных в тканевой ванне, заполняли 5 мл раствора Кребса-Хензелайта, выдерживали при 37 °С и заливали карбогеном. Ткани оставляли для уравновешивания примерно на 20 мин, а затем к каждому кольцу добавляли 8 г натяжения. Изометрическое напряжение было записано, как описано ранее (Roberts et al., 2013).
2.1.2. Экспериментальный протокол
Через 20 мин уравновешивания дважды определяли реакцию на 60 мм KCl. После сокращения с 60 мм KCl ткани промывали и затем преэкстрактировали агонистом тромбоксановых рецепторов U46619 (10 нм) для достижения ~60% сокращения по сравнению со вторым сокращением KCl. В других экспериментах ткани были предварительно сокращены с 30 мм KCl. Как только было достигнуто стабильное сокращение, джуглон был добавлен кумулятивно в ванну (диапазон от 10 -9 м до 10 -5 М). Кумулятивные добавления диметилсульфоксида (DMSO) (0.0001% -0.1% v/v) были добавлены к тканям управлением корабля для того чтобы подтвердить влияние juglone.
2.2. Эндотелийзависимые и независимые эффекты юглона
Для изучения роли эндотелия в индуцированной юглоном вазорелаксации эндотелий сосудов удаляли механическим путем путем растирания просвета тонкой парой щипцов. Удаление эндотелия было подтверждено отсутствием релаксации до 100 нм вещества Р ( Roberts et al., 2013; Wong et al., 2014; San Wong et al., 2015).
2.3. Влияние L-NAME, индометацина и ODQ на релаксационную реакцию к джуглону
Для того, чтобы определить роль оксида азота и простациклина путь в вазодилататорный эффект юглон, в NO-синтазы ингибитор л-наименование (300 мкм), ингибитор циклооксигеназы индометацином (10 мкм), или guanylyl фермента ингибитор адррес odq (10 мкм) (Хайн и Ко, 1999) были добавлены к тканям 45-60 минут до схватки с U46619 и накопления юглон (1 нм–30 мкм). Управление транспортным средством осуществлялось с использованием каждого ингибитора, 0,1% в / в этанола и 0,1% в/в ДМСО с индометацином и ОДК соответственно. Ингибиторы были использованы в концентрациях, которые, как известно, вызывают максимальное ингибирование (Wong et al., 2014).
2.4. Вовлечение калиевых каналов в релаксационную реакцию на юглон
Для определения роли калиевых каналов в индуцированной юглоном релаксации кольца ПКА предварительно инкубировали в присутствии или отсутствии неселективных блокаторов калиевых каналов тетраэтиламмония (Теа) (10 мм) ( Uhiara et al., 2009) или Kv-селективный ингибитор 4-аминопиридина (4-АП) ( 1 мм) (Cole et al., 1996 ) за 45 мин до индуцированного u46619 сокращения. После продолжительной фазы сокращения, джуглон был добавлен кумулятивно.
2.5. Влияние юглона на кальци-индуцированное сокращение
С целью определения вовлечения ca 2+ –притока и кальциевых каналов в вазодилатацию, индуцированную юглоном, кольца пса инкубировали в свободном от Ca 2+ растворе Кребса–Хензелайта в присутствии единичной концентрации юглона (30 мкм). Затем ткани подвергались воздействию 60 мм KCl и строились кривые концентрации-реакции на кумулятивные добавки хлорида кальция ( Roberts et al., 2013). В другой серии опытов ткани предварительно инкубировали с 30 мкм юглоном в течение 45 мин перед кумулятивным добавлением напряжения закрытого кальциевого канала открывателя бухты К8644 (1 нм-30 мкм) (Rae and Calixto, 1989) [41], в кальцийсодержащем буфере Кребса-Хензелайта. В дальнейших экспериментах влияние джуглона на высвобождение внутриклеточных кальциевых магазинов (рианодиновых рецепторов) определяли путем предварительной инкубации тканей с джуглоном (30 мкм) в течение 45 мин до добавления единичной концентрации кофеина (20 мм) или циклопиазоновой кислоты (10 мкм); специфического ингибитора Ca2+ АТФазы ( Sekiguchi et al., 1999 ), или иономицин (10 мкм) ( Dick and Sturek, 1996) в кальцийсодержащем буфере Kreb's-Henseleit. Для исключения того, что сокращение до иономицина не вовлекает кальциевые каналы L-типа, тот же эксперимент был повторен в присутствии нифедипина (10 мкм). Контрольные ткани получил только автомобиль, 0,1% v / V DMSO. В другой серии экспериментов сегменты PCAs предварительно инкубировали с юглоном (30 мкм) в течение 45 мин, а затем с ПМа (100 мкм), активатором протеинкиназы с (ПКК) (Itoh et al., 1988) было добавлено для того чтобы подтвердить влияние juglone на PKC. Контрольные ткани получил только автомобиль, 0,1% v / V DMSO.
2.6. Лекарственные средства и реагенты
Все стандартные препараты, 4-аминопиридина (4-АП), лавровый K8644, кофеин, циклопиазоновая кислота, индометацин, иономицином, Нифедипин, форболовым 12-миристат 13-ацетата (РМА), вещество P, tetraethylammonium (чай), 9,11-Dideoxy-11α,9α-epoxymethanoprostaglandin F2a (U46619), Н(ω)-нитро-L-аргинина метиловый эфир (л-Имя), и смесь испытания: juglone было закуплено от различных стандартных химических компаний, Сигма-Aldrich, США и Tocris Bioscience (Бристоль, Великобритания). Все препараты были растворены в дистиллированной воде, за исключением индометацина и иономицина, которые были растворены в абсолютном этаноле, циклопиазоновой кислоте, Bay K8644 и PMA в DMSO, юглоне в 0,1% DMSO и чае, который был растворен непосредственно в растворе Кребса–Хензелайта. Исходный раствор У46619 (1 мм) растворяли в этаноле и далее разводили в дистиллированной воде.