Резюме: простота взятия проб мочи сочетается с превосходными сенсорными возможностями CRISPR для улучшения диагностического тестирования для пациентов с пересадкой почек, сообщает международная исследовательская группа в журнале Nature Biomedical Engineering.
Новые тестовые экраны предназначены для двух распространенных оппортунистических вирусов, заражающих пациентов с пересадкой почек, цитомегаловируса (CMV) и полиомавируса БК (BKV), а также мРНК CXCL9, экспрессия которой увеличивается во время острого отторжения трансплантации клеток почки.
"Большинство людей думают о редактировании генов, когда думают о CRISPR, но этот инструмент имеет большой потенциал для других применений, особенно для более дешевой и быстрой диагностики", - говорит доктор Михаэль Камински, который возглавляет лабораторию почечной клеточной инженерии и диагностики CRISPR в Центре молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка при Ассоциации им же. Он возглавил разработку теста, работая в лаборатории Коллинза в Массачусетском технологическом институте (MIT). С 2020 года Камински, врач Медицинского отделения Шарите, отделения нефрологии и медицины внутренней интенсивной терапии, основал новую лабораторию в Берлинском институте биологии молекулярных систем (BIMSB) от MDC.
Критическая потребность
Пациенты с пересадкой почек принимают лекарства, подавляющие их иммунную систему, чтобы снизить вероятность отторжения органа. Но это увеличивает их риск заболеть от инфекций. Тщательное наблюдение за пациентами как на предмет инфекции, так и на предмет отторжения является критически важным и определяет тонкий баланс в уходе. Обычно это делается с помощью анализов крови и биопсии почек, которые отнимают много времени, являются более инвазивными и дорогостоящими.
Хотя доступные диагностические тесты на основе мочи доступны для различных биомаркеров, от диабета до беременности, они не были широко адаптированы для нуклеиновых кислот, таких как ДНК или РНК. Вот тут и появляется CRISPR.
Технология CRISPR позволяет найти очень маленькие сегменты последовательности ДНК или РНК, руководствуясь комплементарным кусочком РНК. Она работает в тандеме с определенными типами белков Cas, которые разрезают целевую последовательность, а также с молекулой флуоресцентного репортера. Это так называемое коллатеральное расщепление высвобождает флуоресценцию, указывающую на присутствие мишени. Многие лаборатории изучали диагностический потенциал CRISPR на синтетическом материале, но лишь немногие тестировали реальные клинические образцы.
Положительный или отрицательный
Тестовый набор, формально называемый анализом, использует двухступенчатый процесс. Во-первых, ДНК вирусной мишени в образце мочи должна быть усилена - скопирована достаточно раз, чтобы CRISPR смог ее обнаружить, даже если присутствует только одна молекула-мишень. Команда использовала специальный протокол CRISPR-Cas13, известный как SHERLOCK, для оптимизации процесса анализа вирусной ДНК. Результаты передаются как домашний тест на беременность. Когда полоска бумаги погружается в приготовленный образец, если на полоске появляется только одна строка, результат отрицательный, в то время как две строки указывают на наличие вируса. "Захватывающе видеть результаты на полосках", - говорит Роберт Гринсмит, аспирант первого курса аспирантуры в лаборатории Каминиски и соавтор бумаги.
При очень низких концентрациях мишеней на тестовой полосе часто появляется бледная вторая линия, что может привести к путанице. Таким образом, команда разработала приложение для смартфона, которое объективно анализирует изображения тест-полоски и делает финальный звонок в зависимости от интенсивности линии.
Исследователи использовали аналогичный процесс для маркера отбраковки CXCL9. Там РНК была выделена и усилена, а затем обнаружена опосредованная цель CRISPR-Cas13.
После большой работы по оптимизации методики, исследователи использовали свой анализ для анализа более 100 образцов из пациентов с пересадкой почки. Анализ был очень точным даже при низком уровне BKV или CMV инфекции и правильно выявил признаки острого отторжения клеточного трансплантата.
Следующие шаги
Пока патентная заявка находится на рассмотрении, Камински, который является врачом и клиническим исследователем, заинтересован в проведении более крупных клинических исследований по сравнению с обычными методами мониторинга. Он также хотел бы исследовать способы сделать тест еще более рациональным. В настоящее время образцы должны быть разогреты для подготовки, и тест требует нескольких этапов. Конечной целью является одношаговый процесс, который может количественно измерить несколько параметров. Таким образом, пациенты могут измерить конкретные изменения по отношению к своим индивидуальным базовым показателям.
Каминский отмечает, что этот тест может быть полезен и для других людей с ослабленным иммунитетом, подверженных риску вирусных инфекций, в то время как диагностический подход, основанный на CRISPR, потенциально может быть адаптирован для пересадки других органов.
