Применив технологию редактирования генома CRISPR/Cas9, американские исследователи доктор Вэньхуэй Ху, Кэмел Халили, Лора Карнелл и Вон-Бин Юнг из Медицинской школы Льюиса Каца Университета Темпл в Филадельфии удалили вирус ВИЧ первого типа из ДНК трёх видов животных, включая «очеловеченных» мышей. Исследование опубликовано в научном журнале Molecular Therapy. Сначала исследователям удалось подтвердить результаты своей предыдущей работы (в 2016 году на генетически измененных крысах и мышах с вирусом ВИЧ первого типа учёные смогли исключить вирус из ДНК большей части живых тканей животных), уменьшив экспрессию вирусных генов у мышей примерно на 60-95%. После этого они применили методику на мышах, остро инфицированных Eco-HIV — мышиным эквивалентом ВИЧ-1, а также на мышах, которым до этого ввели иммунные клетки человека. Во всех трёх случаях учёным удалось полностью устранить вирус из ДНК животных.
«В этот раз исследование более обширно. Мы подтвердили данные из предыдущей работы и усилили эффективность своей стратегии редактирования генома. Дополнительно мы продемонстрировали, что она эффективна ещё в двух мышиных моделях: одна представляла собой острую инфекцию в мышиных клетках, а другая — хроническую, или латентную, инфекцию в человеческих клетках», — комментирует доктор Ху.
Полное секвенирование ДНК экспериментальных клеточных линий показало, что первоначально в нем содержались четыре связанные с ВИЧ вставки на 1-й и 16-й хромосомах, и все они были точно и успешно вырезаны CRISPR/Cas9-системой. Более того, если экспрессия генов Cas9 и РНК-гидов в клетке продолжалась, они эффективно защищали её от повторного заражения и встраивания вируса в ДНК.
«Таким образом, редактирование с помощью CRISPR/Cas9 может открыть новые методы терапии для удаления ДНК ВИЧ-1 из CD4-положительных Т-лимфоцитов, – отмечают авторы работы, – и могут стать отправной точкой на пути к полному излечению».
Одна из главных причин, почему лекарство от ВИЧ еще не найдено, заключается именно в способности вируса прятаться в геномах T-клеток, где он латентно существует.
После всего одной инъекции лекарства учёные уничтожили провирус в селезёнке, лёгких, сердце, кишечнике и мозге мышей. Мышам кололи «quadruplex sgRNAs/saCas9 AAV-DJ/8» — улучшенный переносчик аденоассоциированного вирусного вектора. Чтобы оценить успех генетического вмешательства, команда измерила РНК-уровень ВИЧ-1 с помощью биолюминисцентной визуализации. Один из генов ВИЧ был заменен геном флуоресцентного белка. Это позволило наглядно отслеживать работу вируса: при активации его в клетке вырабатывались флуоресцирующие молекулы. Внесение в такие клетки генов Cas9 не сказывалось на функционировании вируса, однако при экспрессии РНК-гидов они начинали связываться с генами ВИЧ, вырезая их из генома.
«Следующий шаг — повторить эксперимент на приматах, более подходящей модели с целью далее продемонстрировать уничтожение ДНК ВИЧ-1 в латентно зараженных T-клетках и других очагах ВИЧ-1, включая клетки мозга. Наша конечная цель — клинические испытания на людях», — цитирует Medical News Today доктора Камеля Халили.
Немного матчасти
ВИЧ-1 описан в 1983 году и является наиболее распространённым и патогенным видом ВИЧ. Глобальная эпидемия ВИЧ-инфекции главным образом обусловлена распространением ВИЧ-1. Также, в подавляющем большинстве случаев, если не оговорено иначе, под ВИЧ в статьях и других работах подразумевают ВИЧ-1.
Вид ВИЧ-1 классифицируют на главную группу М и несколько побочных групп. Считается, что группы M, N, O, P образовались в результате независимых случаев передачи SIV от обезьяны к человеку, и последующей мутации вируса до ВИЧ.
Жизненный цикл ВИЧ
Вначале вирус инфицирует клетку. Связывание с клеткой происходит благодаря рецепторам, в качестве которых служат молекулы CD4. Корецепторами (ответными) становятся рецепторы хемокинов, именно поэтому поражаются клетки иммунной системы: T-лимфоциты (T-хелперы), моноциты, макрофаги, а также клетки мозга (макрофаги, микроглия, астроциты), клетки лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и другие. Затем происходит слияние мембран вируса и клетки и высвобождение вирусной РНК. После этого одноцепочечный РНК-геном с помощью обратной транскриптазы превращается в двухцепочечную ДНК (обратная транскрипция), так называемую провирусную ДНК. Наконец интеграза встраивает двухцепочечную провирусную ДНК в геном хозяина. Эта встроенная информация считывается, причём промоторами (то есть местами, привлекающими РНК-полимеразу для транскрипции) служат длинные концевые повторы — LTR (длинные концевые повторы или long terminal repeat). Собираются новые вирусные частицы, поражающие новые клетки. В целом весь этот процесс приводит к частым мутациям вируса. Особенно вариабельны поверхностные гликопротеины, в том числе поэтому частицы ВИЧ так неуловимы для нашего иммунитета.
Про традиционные методы
Следует отметить, что и развитие «традиционных» медикаментозных методов на месте также не стоит. Так, например, совсем недавно было объявлено о том, что ребёнок был «функционально излечен» от ВИЧ после того, как ему практически сразу после рождения назначили три антиретровирусных препарата: зидовудин, ламивудин и невирапин. Однако специалисты предупредили, что быстрое лечение не всем подходит, но важно начать как можно раньше. Через две недели после того, как ребёнок был вылечен от ВИЧ, учёные заявили, что похожее лечение может помочь и взрослым людям.Считается, что главным является начало лечения на ранних этапах заражения, хотя это и не гарантирует излечения. Профессор Азье Саэс-Сирьона (Asier Sáez-Cirión) из Института Пастера в Париже проанализировал 70 людей с ВИЧ, которых лечили антиретровирусными препаратами между 35 днём и 10-й неделей после инфицирования. У большинства добровольцев болезнь возвращалась после прекращения лечения, и вирус рецидивировал до того уровня, что был до лечения. Но у 14-ти пациентов, среди которых было 4 женщины и 10 мужчин, рецидивов вируса не было после прекращения лечения, которое проводилось в среднем в течение 3 лет.
В данном случае есть несколько серьёзных «НО». Во-первых, у большинства испытуемых тяжелые симптомы проявились на самых ранних этапах заражения, что позволило начать раннее лечение. Во-вторых — у тех самых 14 пациентов уровень наличия ВИЧ в крови был настолько низок, что их организм мог контролировать вирус и без лекарств. Помимо этого проблема заключается в том, что терапия никак не влияет на ДНК вируса у нас в геноме: у пациентов, принимающих антиретровирусную терапию, около 106 клеток содержат провирус — неактивная форма вируса, когда геном вируса интегрирован в геном клетки-хозяина (в случае ВИЧ эти клетки-хозяева называются CD4: как только вирус интегрируется в ДНК CD4-клеток, он себя воспроизводит с каждым новым их поколением). Помимо этого, во время терапии вирусные гены могут считываться на некотором уровне, что вызывает различные осложнения у пациентов с ВИЧ-инфекцией, а при прекращении терапии вирус может снова «активизироваться», что и происходило в большинстве случаев вышеописанного исследования.
В результате ещё одного исследования объединенная группа учёных из Национальных институтов здравоохранения США и Рокфеллеровского университета создала антитела, которые подавляют обезьяний вирус иммунодефицита как минимум на полгода. Исследователи провели тестирование препарата на 13 человекоподобных обезьянах, и уже после трёх инъекций вирус был нейтрализован иммунной системой всех животных в течение трёх недель.
Так или иначе, ВИЧ перестал быть смертным приговором, что не может не обнадёживать, хотя он всё ещё считается неизлечимым, несмотря на эти несколько случаев.
CRISPR/Cas9
Совсем недавно возникли подходы в лечении генетических болезней, которые в той или иной степени позволяют с ними бороться. Эти подходы называются общим понятием «геномное редактирование» и связаны они с развитием одной технологии — CRISPR/Cas. Эта технология пришла к нам из мира бактерий. Дело в том, что бактерии в результате эволюции «придумали» совершенно уникальный способ борьбы с вирусами (а ВИЧ — это именно вирус) — их основными противниками в борьбе за выживание. Они получили возможность «узнавать» генетический материал вируса за счёт комплиментарных взаимодействий. Ещё около тридцати лет назад в их геноме были обнаружены повторяющиеся участки ДНК длиной 20–50 нуклеотидов с неизвестным предназначением, разделённые уникальными последовательностями (спейсерами) такой же длины. В непосредственной близости к этим повторам находились гены различных белков, разрезающих и расплетающих ДНК (cаs-гены). Генетический анализ показал, что эти уникальные участки ДНК гомологичны различным участкам ДНК (протоспейсерам) бактериофагов (вирусов) и плазмид. Так, имея соответствующий спейсер, бактерия становится устойчивой к проникновению чужеродной ДНК. Таким образом, было показано, что CRISPR/Cas система является своеобразной системой бактериального «иммунитета».
В последствии выяснилось, что ровно тот же механизм работает и в клетках высших организмов, включая человека. Для этого необходимо взять бактериальный белок Cas, ввести его в клетку, например, человека, чтобы он «узнал» последовательность ДНК вируса, после чего будет произведён её двухнитевой разрыв.
Достоинство системы заключается в том, что по крайней мере для бактерий она исключительно прецизионна — только в условиях полного соответствия РНК-гида и матрицы ДНК (на расстоянии от 20-ти до 50-ти нуклеотидов) произойдёт взаимодействие, которое приведёт к разрыву «плохой» ДНК. Далее клетка по оставшейся «здоровой» копии ДНК «залечит» разрыв, исключив вредную мутацию, то есть разрезанный ген запускает в клетке систему репарации. При этом появляются различные мутации репарируемого гена — в основном удаления, но бывают и разнообразные вставки. Однако если мы предоставим матрицу для репарации, ген может вернуться к правильной форме. Так можно вносить любые изменения в геном. Это означает, что мы в теории можем лечить генетические заболевания и рак.
Впервые предложенная система была протестирована японскими учеными в 2013 году на культуре клеток человеческих T-лимфоцитов. В качестве мишени они использовали LTR. Трёхкратное внесение в клетки конструкции CRISPR/Cas9 снижало считывание вирусного генома почти в 3 раза (с 97,8% до 35,5%). Дальнейший анализ показал, что почти все клетки содержали в области провируса различные мутации. Так как LTR — это концевые повторы, то разрезание с двух концов теоретически может привести к полному вырезанию встроенного в геном вирусного куска. И действительно — почти у трети клеток (31,8%) после трёхкратного внесения системы CRISPR/Cas9 этот участок полностью удалялся. В данном случае следует понимать, что если целевой участок изменит свою структуру в виду активной мутации вируса, система CRISPR/Cas9 не сможет его найти и обезвредить. Именно поэтому учёные выбрали тот участок LTR, который содержит последовательности ДНК, одинаковые практически у всех подвидов ВИЧ.
В 2014 году подобные исследования провели американские учёные на клетках микроглии, макрофагах и моноцитах, подтвердив успешность такой терапии. А главным достижением этих исследований стало то, что учёным удалось иммунизировать клетки от ВИЧ: они добились того, чтобы клетки постоянно содержали систему CRISPR/Cas9 с соответствующей РНК, направленной против ВИЧ. Клеткам это не повредило, и после заражения ВИЧ встраивание в геном и размножение вируса в них не происходило, что даёт надежду на разработку вакцины от ВИЧ.
В чём подвох?
Следует понимать, что система, созданная бактериями, не способна в полной мере эффективно работать в высших организмах.
Одной из главных проблем этого метода остается его не 100% эффективность, что в случае с ВИЧ означает неизбежный рецидив. Ещё одна проблема — исправление других участков ДНК, похожих на искомую последовательность, или так называемые off-target-эффекты, которые могут затронуть ген, даже если мы не хотели его менять. Так, по результатам исследования применения данной технологии на человеческих эмбрионах в целях лечения генетических заболеваний, передаваемых по наследству, стало ясно, что помимо необходимых в клетках присутствовало ещё большое количество изменений, который были не в тех участках ДНК, в которых это требовалось. Это называется «неспецифическая активность». Стало понятно, что система CRISPR/Cas9 осуществляла «раскусы» не только в тех участках генома, в которых это было необходимо. Это очень серьёзная проблема и пока совершенно понятно, как с этим бороться. Связано это с природой макромолекулярных взаимодействий. Как и говорилось выше, участок ДНК, например, длиной 20 нуклеотидов прочно взаимодействует с гид-РНК. Исключительно статистически понятно, что в клетке существует 3х20 (3 — так как всего 4 нуклеотида) вариантов «правильной» последовательности, отличающейся лишь на 1 нуклеотид от матрицы. То есть 60 последовательностей максимально похожих на ту, которую вы таргетируете. Каждая из них взаимодействует чуть хуже идеала, но их много. В клетке же будет присутствовать 60х60, то есть 3600 последовательностей, отличающихся от матрицы на 2 нуклеотида и т.д. Не смотря на то, что взаимодействие с правильной мишенью самое прочное, количество неправильных, но очень похожих настолько велико, что в огромном количестве случаев редакционный комплекс CRISPR/Cas9 будет находится не там, где это необходимо. И хотя такое «неправильное» взаимодействие будет непрочным, а значит и коротким, в сумме оно будет случаться так часто, что приведёт к разрыву не там, где нужно. После этого будет задействована система репарации, которая сама по себе вносит мутации в геном.
Предполагается, что есть способ борьбы с этой проблемой, если заранее выбирать последовательность, встречающуюся только в гене, который должен стать мишенью Cas9. Так, в уже упомянутом исследовании учёные, подобрав верную последовательность спейсера, комплиментарную вирусному геному, не обнаружили лишних мутаций в человеческом геноме после применения CRISPR/Cas9.
И наконец, проблемой, решения которой пока не видно даже в теории, является доставка системы CRISPR/Cas9 к необходимому участку. Нет понимания, как действовать эффективно на уровне организма человека, где около 106 заражённых клеток.
Именно поэтому не стоит ожидать, что лекарство от ВИЧ уже завтра появится на прилавках. Важно, чтобы как можно большее число исследовательских групп подключались к работе.
Оглавление канала
Подписывайтесь на канал в Telegram, чтобы следить за обновлениями онлайн, и не пропускать интересные новости о науке и технике.