Анна д’Эсте родилась в Ферраре в 1531 году в семье Эрколе 2, герцога Феррарского и Моденского, и Рене, дочери Людовика 12 и Анны Бретонской, наследнице могущественных герцогов Бретани. По линии отца Анна приходилась внучкой Лукреции Борджиа.
Это была эпоха Итальянских войн за престол Неаполитанского королевства. Французский король Генрих 2 выступил в роли свата и предложил отцу Анны выдать дочь за Франциска, герцога Омальского, будущего герцога Гиза.
В 1548 году недалеко от Парижа состоялось бракосочетание. Муж принцессы через брак с ней стал кузеном короля Франции по линии Валуа. Впрочем, сам Франциск был родовит не менее жены и по материнской линии являлся Бурбоном, по отцовской принадлежал к младшей ветви владетельного лотарингского герцогского дома. Отец Анны, герцог д’Эсте дал согласие на брак с лотарингским принцем.
Анна очень гордилась, что она - внучка великого короля, и, как пишет Брантом, в Париже ее прозвали "Внучкой короля - Отца нации". От Валуа Анна унаследовала крайне мало, гораздо более от итальянских предков. Прадедом Анны был печально известный папа Александр Борджиа, которому приписывались убийства и отравления кардиналов и политических врагов. Ее мать, протестантка Рене, была скромна, миролюбива и рассудительна, а Анна – надменна, тщеславна и импульсивна. Анна привнесла во Францию идеи итальянских вендетт, хотя и не особо любила вспоминать о своих итальянских предках.
Она во всем показывала свое превосходство, даже в самых обыденных делах. Ей льстило, когда во время танцев с племянницей по мужу королевой Марией Стюарт придворные уверяли, что она более величественна, чем королева.
Итальянское происхождение Анны помогло ей завязать тесные отношения с Екатериной Медичи. Диана де Пуатье, также была в числе ее приятельниц и продвигала в карьере её мужа, главу дома Гизов. Преданность интересам мужа и католицизму снискали Анне уважение всего клана Гизов.
В 1563 году во время осады Орлеана Франциск был предательски убит. Анна обвинила в организации убийства мужа одного из лидеров гугенотов адмирала Колиньи. Карлу 9 и Екатерине Медичи нужен был мир, а Анна, как истинная итальянка, объявила вендетту. Екатерина пыталась отговорить ее от планов мести. Адмирал поклялся, что не виновен в смерти Гиза, но Анна была непреклонна. В итоге королевский Совет все же признал Колиньи непричастным к убийству герцога.
В 1566 году Анна снова вышла замуж за герцога Немурского из Савойского дома, союзника Гизов. Новое замужество не ослабило влияния Анны на клан Гизов и не помешало ей свирепо требовать мести и воспитывать детей в ненависти к Колиньи. В итоге Екатерина Медичи в 1572 году пошла на компромисс и, формально признавая Колиньи не виновным, не возражала, если Гизы сами расправятся с адмиралом.
В 1572 году герцогиня де Гиз устроила на Колиньи покушение, в котором тот был не убит, а ранен, что привело к Варфоломеевской ночи. И лишь когда ее сын Генрих де Гиз наступил на грудь поверженному врагу, ее месть была полностью удовлетворена.
Анна была вдохновительницей создания Католической Лиги и принимала в ней самое активное участие. Она всячески натравливала своих сыновей на Генриха 3 и не знала в этом покоя. Иногда герцогине казалось, что они недостаточно активны, какими должны быть сыновья Франциска Гиза. И только своей дочерью герцогиней де Монпансье, прозванной «фурией Лиги», она была вполне удовлетворена. Вдвоем с дочерью они стали хозяйками Парижа во время бегства короля в 1588 году после Дня Баррикад.
В 1585 году Анна вновь овдовела. В 1588 году вдовствующая герцогиня Немурская узнала о намерении короля убить её сына Генриха Гиза, но сделать ничего не успела. К ее великому горю, вскоре в Блуа были заколоты Меченый и его брат, кардинал де Гиз.
По приказу Генриха 3 Анна была арестована и заточена в замке Блуа. Стоя перед статуей деда, Людовика 12, она рыдала и спрашивала, зачем он построил этот замок, в котором убили его правнуков. Вскоре Анну освободили, и она вернулась в Париж, где встала во главе Католической лиги. Вместе с герцогиней де Монпансье она призывала народ к мести Валуа. Стоя на балконе своего дворца в Париже, Анна призывала покарать подлого Ирода. Орудием мести стал доминиканский монах - фанатик Жак Клеман. Последний Валуа был обречен.
Во время отсутствия своего сына герцога де Майенна, герцогиня Немурская фактически руководила осажденным беарнцем Парижем. Однако, Майенн к разочарованию матери помирился с Генрихом 4. Но тут уже сыграли роль крупные финансовые инвестиции со стороны короля. Все принцы из дома Гизов постепенно сложили оружие. Герцог д'Эльбеф, получил 970824 ливров. Молодой герцог Гиз, сын Анны, получил самый крупный куш - 3888830 ливров, которые предназначались ему наравне с матерью и братом, герцогом Жуанвиллем, будущим герцогом де Шеврез. Присоединение Майенна стоило 3580000 ливров.
После капитуляции клана Гизов герцогиня Немурская признала Генриха 4 королём. Между ним и вдовствующей герцогиней сложились добрые отношения. После бракосочетания Генриха 4 и Марии Медичи Анна д’Эсте, как одна из самых родовитых особ Франции, стала смотрительницей двора королевы и ее близкой приятельницей.
Анна, пережила двух мужей и трёх взрослых сыновей и умерла в 1607 году в преклонном возрасте на 77 году жизни.