Легенда гласит что в городе Альба-Лонге царем был милостивый и справедливый потомок великого троянского героя Энея — Нумитор. Все было хорошо до того как брата эго Амулия одолела зависть и он стремившийся к царской власти подкупил приближенных царя и обманув Нумитора свергнул эго с престола. Но Амулий не смог убить Нумитора, а для закрепления за собой царской власти сделал дочь Нумитора Рею Сильвию, жрицей богини Весты, а сына его решил убить. Жрицы богини Весты должны были давать обед безбрачия и хранить священный огонь днями и ночами горевший в святилище...

Игровой мир Главным героем игры, как и в Assasin’s Creed II, является ассассин эпохи Возрождения Эцио Аудиторе. Он борется с римскими тамплиерами. В этом ему помогают некоторые известные личности: Леонардо да Винчи, Катерина Сфорца и Никколо Макиавелли. Параллельно события развиваются в нашем времени, здесь героем является Дезмонд Майлз. Он далёкий потомок Эцио, который обучается искусству предков с помощью комплекса «Анимус 2.0» считывающего генетическую память пользователя и погружающего его в прошлое...