Лабораторная диагностика многих инфекционных, гормональных и онкологических заболеваний строится на одном и том же биологическом принципе — узнавании антителом своего антигена.
В основе многих медицинских анализов лежит иммунологический метод. Этот способ использует естественную способность иммунной системы распознавать и запоминать чужеродные вещества. Когда в организм попадает вирус или бактерия, иммунитет вырабатывает специальные белки — антитела. Каждое антитело подходит только к своему конкретному антигену, как ключ к замку. Иммунологический метод как раз и заключается в том, чтобы в пробирке соединить антитело с антигеном и увидеть эту реакцию.
Одним из самых распространённых вариантов такого метода является иммуноферментный анализ, который часто сокращённо называют ИФА. В микробиологии и медицине ИФА используют повсеместно. Суть этого анализа в том, что к антителу или антигену прикрепляют специальную метку — фермент. Когда нужное вещество находится в образце крови или другого биоматериала, фермент даёт химическую реакцию, которая меняет цвет раствора или вызывает свечение. По интенсивности этого сигнала можно не только сказать, есть ли в организме вирус или гормон, но и измерить его количество.
Иммуноферментный анализ — это не единственный иммунологический метод. Существует также вестерн-блоттинг, или иммуноблотинг. В этом случае сначала белки разделяют по размеру с помощью электрического поля, а потом тоже обрабатывают мечеными антителами. Вестерн-блоттинг помогает увидеть не просто наличие антигена, а точно определить его молекулярную массу. Поэтому иммуноблотинг часто используют для подтверждения результатов ИФА, например при диагностике ВИЧ или болезни Лайма.
Ещё один важный иммунологический метод — иммуногистохимия. В отличие от анализов крови, иммуногистохимия работает напрямую с кусочками ткани. Тонкий срез опухоли или другого органа обрабатывают антителами с красителем. Под микроскопом становится видно, в каких именно клетках и где именно в ткани находится нужный белок. Этот метод незаменим в онкологии, когда нужно понять тип опухоли и подобрать правильное лечение.
Главный рабочий инструмент: ИФА (иммуноферментный анализ)
Метод ИФА расшифровывается как иммуноферментный анализ. В микробиологии и в клинической диагностике этот метод встречается очень часто. В основе ИФА лежит та же самая реакция между антителом и антигеном, о которой говорилось во введении. Главная особенность иммуноферментного анализа заключается в использовании фермента. Этот фермент прикрепляется к антителу или к антигену, и его задача — дать понятный и измеримый сигнал. Чаще всего сигнал проявляется в виде изменения цвета раствора или в виде свечения.
Чтобы провести анализ ИФА, лаборант берёт пластиковую плашку с лунками. В каждую лунку он добавляет образец крови, сыворотки или мочи. Затем в лунки вносятся специальные реагенты с ферментом и антителами. Если в образце есть нужный антиген, он связывается с антителом, потом фермент реагирует с добавленным веществом, и жидкость меняет цвет. Чем темнее цвет, тем больше в образце искомого вещества. Специальный прибор — фотометр — измеряет плотность окраски и выдаёт точное число.
Иммуноферментный анализ ИФА бывает разных типов. Самый распространённый тип называется твёрдофазным ИФА. В этом случае одно из реагирующих веществ (например, антитела) заранее закреплено на стенках лунки. Остальные компоненты добавляются по очереди, а между этапами лишнее смывается. Это позволяет добиться высокой точности и убрать всё, что может помешать реакции. Другой тип — конкурентный ИФА — используется, когда нужно измерить маленькие молекулы, например гормоны.
Что показывает анализ ИФА в реальной медицине? Во-первых, с помощью ИФА можно выявить антигены самого возбудителя. Например, при гепатите В определяют поверхностный антиген вируса. Во-вторых, с помощью ИФА находят антитела, которые организм выработал на инфекцию. Анализ на антитела к COVID-19 — это тоже ИФА. По тому, какие антитела нашлись (IgM или IgG), врач понимает, болеет человек сейчас или переболел раньше. В эндокринологии ИФА измеряет уровень гормонов щитовидной железы, инсулина и кортизола. В аллергологии с помощью ИФА можно обнаружить антитела к разным аллергенам.
Иммуноферментный анализ считается очень надёжным методом. Его чувствительность позволяет находить ничтожно малые количества вещества — до одной миллиардной грамма на миллилитр. При этом ИФА не требует сложного и дорогого оборудования. Стандартный планшетный фотометр и набор реагентов есть в большинстве лабораторий. Ещё один плюс — возможность полностью автоматизировать процесс. Многие анализаторы сами смешивают реагенты, смывают, измеряют и выдают готовый результат. Благодаря этому ИФА остаётся самым массовым иммунологическим методом в клинической диагностике.
Когда ИФА недостаточно: вестерн-блоттинг (иммуноблотинг)
Вестерн-блоттинг часто называют иммуноблотингом. Это ещё один иммунологический метод, который работает с антителами и антигенами. Вестерн-блоттинг даёт больше информации, чем обычный ИФА. Он не просто сообщает, есть ли в образце нужный белок, но и показывает, какого размера этот белок. Для врача или исследователя это очень ценный дополнительный факт.
Как проводится вестерн-блоттинг. Сначала биологический образец — например, клетки крови или кусочек ткани — разрушают и получают смесь всех белков, которые в нём были. Эту смесь пропускают через специальный гель под действием электрического тока. Белки начинают двигаться в геле, и чем они мельче, тем быстрее и дальше они уходят. В результате все белки выстраиваются вдоль геля в порядке увеличения их молекулярной массы. Этот этап называется электрофорезом.
После электрофореза белки переносят из хрупкого геля на твёрдую мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилдифторида. Перенос тоже делают с помощью электричества, чтобы каждый белок оказался на мембране точно в том же месте, где он остановился в геле. Теперь мембрану обрабатывают раствором с антителами к тому белку, который ищут. Если искомый белок присутствует в исходном образце, антитела свяжутся с ним прямо на мембране. Затем добавляют вторые антитела с ферментом, и на мембране появляется цветная или светящаяся полоса. Положение этой полосы на мембране соответствует массе белка.
В медицинской практике иммуноблотинг чаще всего используют для подтверждения диагноза. Например, при подозрении на ВИЧ сначала делают скрининговый ИФА. Если ИФА даёт положительный результат, обязательно проводят вестерн-блоттинг. В этом тесте можно увидеть отдельные полосы, которые соответствуют разным белкам вируса — оболочке, ядру, ферментам. Если на мембране появляются полосы сразу от нескольких вирусных белков, диагноз считается подтверждённым. Такой двухэтапный подход позволяет избежать ошибок.
Другой важный пример — болезнь Лайма, которую переносят клещи. Иммуноферментный анализ на боррелиоз иногда даёт ложноположительные результаты из-за перекрёстных реакций с другими бактериями. В таких случаях вестерн-блоттинг помогает разобраться. Врач смотрит на мембрану и видит характерный рисунок полос для каждого возбудителя. Один паттерн полос говорит о настоящей инфекции, другой — о ложноположительном результате. Без вестерн-блоттинга пациент мог бы получить неправильное лечение.
В научных исследованиях вестерн-блоттинг тоже очень нужен. Учёные изучают, как меняется количество того или иного белка в клетках при разных условиях. Например, добавляют лекарство и смотрят, становится ли полоса белка толще или тоньше по сравнению с контрольным образцом. Благодаря этому методу можно понять, на какой белок действует новый препарат. Ещё вестерн-блоттинг помогает проверить, действительно ли генетически модифицированная клетка производит тот белок, который в неё встроили. Иммуноблотинг остаётся важным инструментом в молекулярной биологии и клинической лабораторной диагностике.
Смотрим прямо в ткани: иммуногистохимия (ИГХ)
Иммуногистохимия — это иммунологический метод, который работает не с кровью или раствором, а с кусочками тканей. Врач или исследователь берёт небольшой образец опухоли, печени, кожи или другого органа. Этот образец замораживают или заливают специальным составом, чтобы он стал твёрдым. Затем из него нарезают тончайшие срезы толщиной в несколько микрометров — тоньше человеческого волоса. Эти срезы помещают на предметное стекло и готовятся к окрашиванию.
Как работает иммуногистохимия. На стекло со срезом ткани наносят раствор с антителами, которые настроены против нужного белка. Эти антитела соединены с красителем или ферментом, который даёт цветную реакцию. Если в ткани есть искомый белок, антитела связываются с ним прямо в клетках. После добавления специального реагента те участки, где произошло связывание, окрашиваются в характерный цвет — чаще всего в коричневый, красный или чёрный. Лаборант смотрит на срез под микроскопом и видит, какие именно клетки и даже какие части клеток окрасились.
В медицине иммуногистохимия чаще всего применяется в онкологии. Когда хирург удаляет опухоль, патологоанатом исследует её под обычным микроскопом. Но иногда клетки выглядят настолько необычно, что непонятно, из какой ткани они произошли. Это называется плохо дифференцированной или анапластической опухолью. Иммуногистохимия помогает определить происхождение такой опухоли. Если клетки окрасились антителами к белку щитовидной железы, значит, это метастаз рака щитовидной железы. Если окрасились к белку лимфоцитов — значит, это лимфома.
Другая важная задача иммуногистохимии — подбор таргетной терапии. Некоторые современные лекарства работают только в том случае, если на поверхности раковых клеток есть определённые рецепторы. Самый известный пример — рак молочной железы. Для него определяют три рецептора: рецептор эстрогена, рецептор прогестерона и белок HER2. Иммуногистохимический анализ показывает, сколько клеток опухоли содержат эти белки и насколько ярко они окрашиваются. Если рецептора HER2 много, назначают специальный препарат трастузумаб. Если рецепторов эстрогена много, подходят гормональные лекарства.
В иммуногистохимии важно уметь правильно оценивать результат. Опытный врач смотрит не только на то, окрасилась клетка или нет. Он оценивает процент окрашенных клеток, интенсивность окраски и расположение окрашенных участков внутри клетки — в ядре, в цитоплазме или на мембране. Для каждого типа опухоли и каждого маркера существуют чёткие критерии. Например, для HER2 результат может быть от нуля до трёх плюсов. Результат три плюса означает, что лекарство точно подойдёт. Результат два плюса считается пограничным, и тогда назначают дополнительный метод — флуоресцентную гибридизацию.
Иммуногистохимия помогает не только в диагностике рака, но и в изучении других болезней. При аутоиммунных заболеваниях этот метод показывает, какие клетки атакует собственная иммунная система. При болезни Альцгеймера иммуногистохимия выявляет аномальные отложения белков в нервной ткани. При инфекционных заболеваниях можно увидеть самих возбудителей или вызванные ими изменения в клетках. Благодаря иммуногистохимии врач видит болезнь буквально на клеточном уровне, а это помогает ставить точные диагнозы и выбирать правильное лечение.
Коротко о других иммунологических методах
Помимо ИФА, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии существуют и другие иммунологические методы. Они применяются в лабораториях для разных задач и стоят того, чтобы о них знать хотя бы коротко. Иммунохроматография — это тот метод, который люди видят в повседневной жизни. Любой тест-полоска на COVID-19, на беременность или на наркотики работает именно на этом принципе. Внутри полоски находятся антитела с красителем. Когда капля жидкости смачивает полоску, жидкость движется по мембране. Если в образце есть нужный антиген, он связывается с антителами, и на полоске появляется цветная линия. Иммунохроматография даёт ответ «да» или «нет» в течение десяти-пятнадцати минут и не требует оборудования.
Реакция непрямой гемагглютинации, или РНГА, использует эритроциты. На поверхность эритроцитов искусственно прикрепляют антигены. Если в образце пациента есть антитела к этим антигенам, то антитела склеивают эритроциты между собой. На дне пробирки вместо осадка в виде точки образуется рыхлый кружевной осадок. Этот старый, но надёжный метод до сих пор используют для диагностики брюшного тифа, туляремии и некоторых других инфекций. РНГА очень проста и не требует дорогих приборов, а результат оценивается просто глазом.
Радиоиммунный анализ когда-то был самым чувствительным методом. В нём вместо фермента используют радиоактивную метку. Специальный счётчик измеряет количество радиоактивных распадов, и по этому числу вычисляют концентрацию вещества. Радиоиммунный анализ может обнаружить невероятно маленькие количества гормонов или лекарств — до одной триллионной грамма. Однако из-за работы с радиоактивными веществами этот метод требует особых мер безопасности и специального разрешения. Поэтому в обычных лабораториях его почти не используют, уступая место ИФА и другим безопасным методам.
Проточная цитометрия — это современный метод, который сочетает иммунологию и лазерные технологии. Клетки в потоке жидкости пропускают поодиночке через лазерный луч. Если клетки предварительно обработать антителами с флуоресцентными метками, то каждая меченая клетка начинает светиться. Машина считает количество светящихся клеток и измеряет яркость свечения. В клинической практике проточную цитометрию используют для анализа лимфоцитов крови. Это помогает диагностировать лейкозы, лимфомы и иммунодефицитные состояния. Метод может определять до двадцати разных маркеров на одной клетке одновременно.
Иммуноэлектрофорез объединяет электрофорез и реакцию с антителами. Сначала смесь белков разделяют в геле, как в вестерн-блоттинге. Потом в гель вырезают канавку и заливают в неё антисыворотку, содержащую много разных антител. Антитела диффундируют из канавки в гель, а белки диффундируют из дорожек навстречу. Там, где антитело встречает свой белок, образуется дугообразная линия осадка. По положению и форме дуг врач понимает, какие белки присутствуют и в каком количестве. Этот метод помогает диагностировать нарушения в системе комплемента или избыток иммуноглобулинов при некоторых болезнях крови.
Каждый из перечисленных методов занимает свою нишу в лабораторной диагностике. Иммунохроматография хороша для экспресс-тестов у постели больного. РНГА и иммуноэлектрофорез остаются надёжными бюджетными методами в небольших лабораториях. Проточная цитометрия нужна в крупных онкологических центрах для точной диагностики лейкозов. Радиоиммунный анализ применяется только в специально оборудованных лабораториях научных институтов. Все эти методы объединяет одно общее свойство — они используют реакцию антитела с антигеном для того, чтобы врач получил нужную информацию о состоянии пациента.
Типичные ошибки в понимании иммунологических методов
Даже самые точные иммунологические методы могут давать результаты, которые неправильно понимают пациенты и иногда начинающие врачи. Одна из частых ошибок связана с тем, что ИФА может определять либо антиген, либо антитела, но не оба варианта в одном тесте. Лаборант всегда выбирает, что именно он ищет. Если человек сдал анализ на антитела к вирусу, а в инструкции написано «определение антигена», то это два совершенно разных теста. Пациент иногда думает, что любой положительный результат говорит об инфекции, но это не всегда так.
Другое распространённое заблуждение касается положительного ИФА на антитела. Положительный анализ не всегда означает, что человек болеет прямо сейчас. Антитела класса G, или IgG, могут сохраняться в крови годами и даже десятилетиями после перенесённой инфекции. Например, антитела к вирусу краснухи или кори остаются на всю жизнь. Врач видит положительный ИФА, а пациент думает, что у него острая инфекция, хотя на самом деле это просто память иммунной системы о давней встрече с вирусом. Именно поэтому для постановки диагноза часто смотрят не просто наличие антител, а их класс. Антитела класса M, или IgM, появляются первыми и исчезают через несколько недель — они указывают на свежую инфекцию.
Третья ошибка связана с вестерн-блоттингом и иммуногистохимией. Некоторые люди считают, что если вестерн-блоттинг показал полосу, значит, болезнь есть и она тяжёлая. На самом деле иммуноблотинг интерпретирует не любая полоса, а определённый набор полос. В диагностике ВИЧ одна полоса на белок оболочки без других полос не считается положительным результатом. Нужно не меньше двух-трёх полос от разных белков вируса. При гепатите С тоже есть свои критерии: какие именно полосы должны появиться на мембране. Без понимания этих правил положительный вестерн-блоттинг может напугать человека зря.
Четвёртый важный момент — иммуногистохимия не даёт количественного результата в привычных единицах измерения. Нельзя сказать, что в опухоли содержится 37 нанограмм белка на миллиграмм ткани. Иммуногистохимия даёт полуколичественную оценку: процент положительных клеток и интенсивность окраски от нуля до трёх плюсов. Два разных врача могут немного по-разному оценить один и тот же срез, особенно если окраска промежуточная. Поэтому при спорных результатах, например для HER2 при раке молочной железы, назначают дополнительный метод — флуоресцентную гибридизацию in situ, или FISH. Этот метод считает количество копий гена и даёт точное число.
Пятая частая ошибка — попытка сравнить результаты, полученные разными методами. Человек может сдать ИФА на антитела к коронавирусу в одной лаборатории, а через неделю в другой и получить разные цифры. Это не значит, что один метод плохой или лаборанты ошиблись. Разные наборы реагентов могут использовать разные антигены, разные шкалы измерения и разные пороговые значения. Норма или референсные значения всегда указаны в бланке анализа, и их нельзя переносить из одной лаборатории в другую. Точно так же нельзя сравнивать результат ИФА с результатом вестерн-блоттинга — это разные методы с разной чувствительностью.
Шестая ошибка касается времени выполнения анализов. Пациент может получить отрицательный ИФА на антитела к ВИЧ через две недели после возможного заражения и успокоиться, хотя инфекция есть. Иммунной системе нужно время, чтобы выработать антитела в detectable количестве. Этот период называется окном. Для ВИЧ окно составляет от двух до двенадцати недель в зависимости от теста. Для гепатитов и других инфекций сроки свои. Отрицательный ИФА слишком рано после заражения ничего не значит. Лаборатории всегда предупреждают об этом в памятках, но не все пациенты их читают. Понимание этих нюансов помогает правильно пользоваться иммунологическими методами и не делать поспешных выводов.
Иммунологические методы, такие как ИФА, вестерн-блоттинг и иммуногистохимия, позволяют врачам и учёным с высокой точностью находить в организме нужные вещества, будь то белки вирусов, гормоны или маркеры опухолей. Каждый из этих методов решает свои задачи: иммуноферментный анализ подходит для массовых скринингов, иммуноблотинг уточняет диагноз, а иммуногистохимия показывает расположение белка прямо в тканях. Понимание того, что именно определяет анализ и как правильно интерпретировать его результат, помогает избежать ошибок и делает иммунологическую диагностику надёжным помощником в современной медицине.
Ранее ученые заявили, что у японских белок с возрастом развиваются человеческие наследственные болезни.