Определение термина «пробиотики» включает в себя живые микроорганизмы, а именно бактерии и дрожжи, со свойствами, обуславливающими повышение здоровья и безопасность при потреблении, что подтверждается их использованием на протяжении тысяч лет человеческой истории. Молочнокислые бактерии и бифидобактерии – это традиционные виды пробиотических бактерий, широко документированные и коммерциализированные. Однако, список коммерческих пробиотических культур постоянно обновляется и дополняется и в ландшафте пробиотиков появляются различные виды, такие как вид Propionibacterium freudenreichii, который филогенетически связан с бифидобактериями. Другими словами, стоит очень близко в генетическом родстве с молочнокислыми бактериями. В этой статье мы хотим познакомить вас с основными биологическими свойствами бактерии Propionibacterium freudenreichii и ее пробиотическим потенциалом (рис. 1).
Propionibacterium freudenreichii — это грамположительная, с высоким содержанием GC (отношение гуанина к цитозину) обуславливает вариабельность генома, мезофильная, аэротолерантная, неподвижная, не спорообразующая бактерия, которая демонстрирует низкие потребности в питании и выживает в суровых условиях. Что касается морфологии, то это плеоморфный стержневой микроорганизм с тенденцией к агрегации, образующий кластеры, напоминающие китайские иероглифы, а также формирует кокковидные клетки и их цепочки. Эта бактерия, выделенная из образцов сыра Эмменталь, была впервые описана Орлой Йенсеном и фон Фрейденрайхом в 1906 году. Согласно исследованиям, проведенным в одной из Европейских медицинских клиник в 2017 году, штаммы Propionibacterium freudenreichii были идентифицированы в фекальных образцах из дискретной когорты недоношенных младенцев, находящихся на грудном вскармливании, что свидетельствует о том, что они могут быть компонентом здоровой микробиоты кишечника человека.
Propionibacterium freudenreichii может использовать в качестве единственного источника углерода (глицерин, эритриол, L-арабинозу, адонитол, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-манозу, инозитол, арбутин, эскулин, лактозу, лактат и глюконат) в процессе ферментации для получения пропионата, ацетата, сукцината и углекислого газа (CO2). В отличие от других видов, Propionibacterium freudenreichii способен метаболизировать пируват в пропионат с помощью цикла транскарбоксилазы (также называемого циклом Вуда-Веркмана), который представляет собой циклический процесс, связанный с окислительным фосфорилированием, который обеспечивает более высокий выход АТФ, чем у других бактерий, продуцирующих пропионат. В свою очередь, пируват является молекулой метаболических узлов, которая может использоваться либо для синтеза ацетата, генерующего NADH, либо для синтеза пропионата, потребляющего NADH. В зависимости от штамма бактерия модулирует пропорции пирувата, которые превращаются в пропионат или окисляются в ацетат и CO2, тем самым поддерживая окислительно-восстановительное равновесие. В молочных матрицах при производстве сыров газ CO2, который образуется во время ферментации, формирует пузырьки, которые медленно диффундируют, создавая характерные отверстия или «глаза», в сырной архитектуре. Вкус сыра связан с пропионатом и ацетатом, а также с продуктами катаболизма аминокислот и гидролиза жира пропионибактериями. Важно отметить, что все молочные продукты, содержащие Propionibacterium freudenreichii, обладают противовоспалительными свойствами, повышая признание этой бактерии и ее продуктов в качестве оздоровительных. Поэтому молочные пропионибактерии считаются бактериями 2-в-1, как с ферментативными, так и пробиотическими свойствами, что делает их идеальными для развития здоровой ферментированной пищи. Propionibacterium freudenreichii — бактерия, которая также хорошо известна как продуцент витамина B12 (кобаламина). Витамин В12 — это водорастворимый витамин, который играет ключевую роль в функционировании мозга, нервной системы и в системе кроветворения. Это также кофактор метилмалонил-CoA-мутазы, которая катализирует ключевой блок в ферментативном пути производства пропионата.
Производство витамина В12, органических кислот, трегалозы и других метаболитов, а также безопасное использование в качестве закваски для созревания сыра и пробиотических кормовых добавок делают эту бактерию привлекательной для многих биотехнологических процессов. Таким образом бактерия Propionibacterium freudenreichii — была признана в качестве пробиотика с уникальными свойствами, положительно влияющими на людей и животных. А способность этой бактерии утилизировать Лактат делают ее незаменимой при лечении коров с острым ацидозом и для его профилактики!
Что касается толерантности к стрессу и адаптации к желудочно-кишечному тракту, то некоторые штаммы Propionibacterium freudenreichii выработали мутации, включающие морфологические и протеомные модификации. Другими словами, Propionibacterium freudenreichii чрезвычайно быстро адаптируются под изменяющиеся критические условия. В лаборатории эти мутации были проверены во время реакции устойчивости к кислоте у штамма Propionibacterium freudenreichii — SI41, который был исследован с помощью кинетического производства белков напряжения во время кислотной адаптации. В результате биотин-карбоксил-носитель и белки, участвующие в синтезе и репарации ДНК, были связаны с ранней кислотной стрессовой реакцией, в то время как чаперонины GroEL и GroES были связаны с поздней кислотной стрессовой реакцией. Таким образом, эти свойства штамма Propionibacterium freudenreichii — SI41 позволяют ему выживать в агрессивных кислотных условиях. Анализ с тем же штаммом показал, что желчные соли (смесь холата и дезоксихолата) вызвали резкие морфологические изменения и индукцию белков, связанных с зондированием и трансдукцией сигнала, общим стрессом и альтернативным сигма-фактором. Тот же штамм был использован в последующем комплексном исследовании, которое включало изменение условий температуры, кислоты и желчных солей для изучения толерантности Propionibacterium freudenreichii — SI41. В результате каждая форма стресса индуцировала специфические белки, но шесть из них были общими для всех стрессов, включая сопровождающие и белки, участвующие в энергетическом метаболизме и восстановлении окислительного стресса! Исследование in vitro, в котором исследовали спектр из 13 штаммов Propionibacterium freudenreichii, показало, что большинство из них имели высокую толерантность к смоделированным желудочным сокам с разным рН и состояниями тонкого кишечника. Данные, полученные в лабораториях, свидетельствуют о том, что бактерия Propionibacterium freudenreichii — прекрасный кандидат в пробиотики для широкого спектра животных не зависимо от особенностей пищеварения. В ряде работ было показано, что штамм Propionibacterium freudenreichii — SI41 метаболически и физиологически адаптируется к среде толстой кишки свиней, с изменениями в углеводном метаболизме, пониженной регуляцией генов стресса и повышением регуляцией генов деления клеток. Кроме того, использование пищевых транспортных средств для доставки Propionibacterium freudenreichii — SI41, таких как сыр, ферментированное молоко, диоксид кремния, отруби, мука повысило его устойчивость к стрессовой среде желудочно-кишечного тракта.
Также были изучены другие аспекты устойчивости Propionibacterium freudenreichii к стрессовым условиям, такие как долгосрочная нехватка питательных веществ. Скрининг был проведен с восемью штаммами Propionibacterium freudenreichii, которые инкубировали в течение нескольких дней после начала стационарной фазы без дальнейшего добавления питательных веществ. Они показали высокие показатели выживаемости и отсутствие лизиса (разрушения клеток), что указывает на то, что эти штаммы адаптируются к долгосрочной нехватке питательных веществ, используя жизнеспособное, но не культивируемое (покоящееся) состояние. Штамм Propionibacterium freudenreichii — SI41 был дополнительно изучен в этих условиях инкубации, и было показано, что высокая популяция сохранялась, даже после истощения глюкозы, предпочтительного источника углерода. Анализ РНК-seq показал, что несколько метаболических путей находились в резко сниженной активности.
Еще одной важной особенностью Propionibacterium freudenreichii во время реакции на стресс является накопление трегалозы. Исследование, которое предполагало изучение этой бактерии во время адаптации к осмотическому, окислительному и кислотному стрессу, показало, что путь трегалозы-6-фосфатинтазы/фосфатазы (OtsA-OtsB), связанный с синтезом трегалозы, был чрезмерно активирован в этих условиях. Другое исследование было сосредоточено на реакции на стресс на низкую температуру (4°C), состояние, которое имитирует условия созревания сыра. В результате семь штаммов P Propionibacterium freudenreichii продемонстрировали замедленный клеточный метаболизм, реакцию на холодный стресс и накопление трегалозы и гликогена. Propionibacterium freudenreichii также накапливает глицин бетаин, гликоген, трегалозу и полифосфаты при культивировании в гиперконцентрированных средах. Накопление трегалозы вместе с глицином бетаином было дополнительно проверено в технологическом контексте, когда жизнеспособность бактерий была увеличена во время распылительной сушки и хранения за счет оптимизации состава среды роста и термической адаптации. Было также показано, что соотношение концентраций этих внутриклеточных осмопротекторов, трегалозы и глицина бетаина, модулирует толерантность к стрессу во время адгезии к клеткам кишечника, что является еще одной важной особенностью пробиотиков, которая способствует их местному благотворному действию. Ранние исследования показали способность нескольких пробиотических бактерий, включая Propionibacterium freudenreichii, прилипать к гликопротеинам и слизи из кишечного тракта человека и животных. В случае Propionibacterium freudenreichii адгезия некоторых штаммов к клеткам кишечной кишки свиньи составляла от 25 до 35%, и эта доля была выше с добавлением CaCl2. В случае с человеком-хозяином несколько штаммов бактерий было проверено на адгезию к клеткам толстой кишки HT-29 in vitro; наиболее адгезивным штаммом был Propionibacterium freudenreichii — CIRM-BIA129, а ключевая роль белка поверхностного слоя B (slpB) в адгезии была продемонстрирована с помощью инактивации гена. Другое исследование показало, что бактериальная адгезия к иммобилизованной слизи может быть синергетически улучшена путем введения комбинаций штаммов, таких как P. freudenreichii в сочетании со штаммами рода Bifidobacterium или Lactobacillus.
В ряде исследований отражены данные, показывающие выраженный антагонизм Propionibacterium freudenreichii в отношении патогенных штаммов. Propionibacterium freudenreichii снизил на 39% адгезию S. aureus к кишечной слизи человека и на 27% ее жизнеспособность, вероятно, из-за производства органических кислот. Сообщалось, что Propionibacterium freudenreichii — PTCC 1674 выделяет липопептидный биосурфактант с антимикробной активностью в основном против Rhodococcus erythropolis, и антиадгезивной активностью в основном против Pseudomonas aeruginosa. Кроме того, Propionibacterium freudenreichii — DSM 20270 значительно ингибировал рост E. coli O157:H7 in vitro.
Propionibacterium freudenreichii также показал антипатогенные свойства у животных. P. freudenreichii B-3523 и B-4327 повлияли на ингибирование и задержку размножения, подвижности и адгезии у штаммов сальмонеллы к эпителиальным клеткам птиц in vitro. Последующее исследование показало, что бесклеточные супернатанты культур одних и тех же пробиотических штаммов Propionibacterium freudenreichii были бактерицидными против множественной лекарственной устойчивости Salmonella enterica serovar Heidelberg. Анализы in vivo также показали, что пробиотические штаммы Propionibacterium freudenreichii уменьшают колонизацию патогена и распространение в печень у индейки. Кроме того, было показано, что потребление Propionibacterium freudenreichii ограничивает и задерживает колонизацию кишечного тракта мышей патогеном Citrobacter rodentium.
В соответствии с синергией, наблюдаемой с точки зрения адгезии, были предложены пробиотические комбинации для улучшения антипатогенной активности, такие как комбинация Propionibacterium freudenreichii — JS, L. rhamnosus GG и LC705 и B. breve 99, которая способствовала ингибированию, смещению и конкуренции с несколькими патогенными видами, такими как S. enterica, Listeria monocytogenes и Clostridium difficile. В другом исследовании штамм Propionibacterium freudenreichii — JS снизил адгезию Helicobacter pylori к клеткам кишечника Caco-2 при индивидуальном использовании, также стабилизировал клеточные мембраны, улучшил функцию эпителиального барьера и модулировал воспалительные цитокины при использовании в сочетании со штаммами L. rhamnosus и B. breve. Многообещающие результаты при экспериментах со штаммами Propionibacterium freudenreichii в контексте канцерогенеза кишечника получают специалисты онкологи по всему миру. Первопроходческое исследование показало, что Propionibacterium freudenreichii — ITGP18 и Propionibacterium freudenreichii — SI41 могут вызывать апоптоз культивируемых клеточных линий колоректальной карциномы человека in vitro, и этот эффект был опосредован короткоцепочечными жирными кислотами, такими как пропионат и ацетат, действующими на митохондрии раковых клеток. Далее было выяснено, что антиканцерогенный эффект модулировался внеклеточными сдвигами рН; а при кислотном рН режим гибели клеток изменился с апоптоза на некроз в клетках HT-29 толстой кишки человека. Эти эффекты были подтверждены in vivo у крыс.
Другой штамм, Propionibacterium freudenreichii — ITG P9, также использовался для разработки ферментированного молока с антионкогенным потенциалом, поскольку он индуцировал апоптоз в культивируемых клетках рака желудка человека HGT-1 in vitro. Затем это ферментированное молоко было предложено в качестве адъюванта при терапии колоректального рака на основе связанного с TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), из-за возможного синергетического эффекта между бактерией и TRAIL, который был подтвержден повышением цитотоксической активности в клетках HT-29. В другом исследовании исследовали перекрестные помехи между бактерией и раковыми клетками: последние производят лактат в результате метаболического сдвига, называемого «аэробным» гликолизом или «эффектом Варбурга»; затем лактат может использоваться этой бактерией в качестве источника углерода. Что касается модуляции состава микробиоты, то было показано, что потребление молочных пропионибактерий усиливает кишечные популяции бифидобактерий. В соответствии с этим стимуляция бифидогенного роста наблюдалась в бесклеточном фильтрате и клеточном экстракте метанола, полученном из культур Propionibacterium freudenreichii. В результате эксперимента очистили компонент бифидогенного стимулятора роста, определили его химическую структуру (2-амино-3-карбокси-1,4-нафтохинон, ACNQ) и продемонстрировали его бифидогенную активность в концентрации 0,1 нг/мл. Сообщалось, что другой штамм, Propionibacterium freudenreichii — ET-3, производит 1,4-дигидрокси-2-нафтоевую кислоту (DHNA) в концентрациях 10 мкг/мл, что также стимулировало рост бифидобактерий. Благотворное действие DHNA было позже подтверждено in vivo с использованием мышей с колитом, индуцированным 2,0% декстрансульфатом натрия (DSS). DHNA ослабляет воспаление за счет модуляции кишечной бактериальной микробиоты и подавления инфильтрации лимфоцитов. Таким образом пробиотики с содержанием штаммов Propionibacterium freudenreichii эффективно снижают воспаления!
Существует все больше доказательств, как in vitro, так и in vivo, что Propionibacterium freudenreichii оказывает иммуномодулирующее действие несколькими механизмами, зависящими от штамма. Например, скрининг на индукцию IL-10 в мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMC) был проведен у 10 штаммов Propionibacterium freudenreichii, в результате чего были выбраны два наиболее противовоспалительных штамма: P. freudenreichii ITG P20 (эквивалент CIRM-BIA129) и SI48. В том же исследовании штамм P. freudenreichii SI48 был дополнительно протестирован in vivo у мышей с острым колитом, индуцированным тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), было показано значительное снижение воспалительных и гистологических маркеров колита.
Роль P. freudenreichii в модуляции иммунологической реакции хозяина стала еще более актуальной при выявлении комменсального штамма человека. Было продемонстрировано, что Propionibacterium freudenreichii — UF1 является компонентом микробиоты кишечника недоношенных младенцев, которых кормили грудным молоком человека, и для смягчения воспалительных заболеваний кишечника. Кроме того, этот штамм модулировал кишечный иммунитет мышей против патогена, в частности, против системной инфекции L. monocytogenes, регулируя клетки Th17. Этот благотворный эффект был подтвержден у новорожденных мышей, которые были восприимчивы к кишечной патогенной инфекции, но их защита была усилена этим штаммом, особенно за счет увеличения защитных клеток Th17 и регуляторных Т-клеток.
Что касается бактериальных факторов, участвующих в иммуномодуляции, то данные указывают в основном на поверхностные белки. Протеом штамма Propionibacterium freudenreichii — CIRM-BIA129 был исследован с идентификацией поверхностных белков и выявления их роли в индукции высвобождения IL-10 и IL-6. Среди выявленных белков были белки, ремоделирующие клеточную стенку, транспортные белки, иные белки участвующие во взаимодействии с хозяином. Мультиштаммное и мультиомическое исследование, проведенное Дойчем, уточнило, что цитоплазматические белки также могут иметь отношение к иммуномодуляции, но подтвердило ключевую роль белков поверхностного слоя B (SlpB) и E (SlpE), особенно в штамме Propionibacterium freudenreichii —CIRM-BIA129. Затем было показано, что SlpB имеет решающее значение для бактериальной адгезии к эпителиальным кишечным клеткам, и мутация в его гене имела плейотропный эффект, предполагая, что этот белок может играть центральную роль в клеточных процессах. Кроме того, анализы in vivo, которые проводились у мышей с мукозитом, индуцированным 5-Ftourouracil (5-FU), показали, что белок SlpB имеет решающее значение для цитокиновой модуляции, инициированной Propionibacterium freudenreichii — CIRM-BIA129. Кроме того, было показано, что гликозилированный белок большого поверхностного слоя A (LspA) комменсального штамма Propionibacterium freudenreichii — UF1 регулирует взаимодействие с рецептором SIGNR1, который регулирует дендритные клетки и противодействует патогенному воспалению, поддерживая гомеостаз кишечника.
В целом, исследования Propionibacterium freudenreichii консолидируют его роль в качестве пробиотика благодаря нескольким выдающимся особенностям, таким как толерантность к стрессам, встречающимся в желудочно-кишечном тракте, адгезия к клеткам-хозяинам, антипатогенная активность, противораковый потенциал и иммуномодулирующие свойства. Кроме того, этот вид имеет технологическое значение благодаря давнему применению в производстве продуктов питания, витамина В12 и органических кислот. Таким образом, это перспективная бактерия 2-в-1 с ферментативными и пробиотическими свойствами. Новые исследования Propionibacterium freudenreichii должны позволить разработать новые пробиотические продукты, положительно влияющие на продуктивность сельскохозяйственных животных!
Данная статья представлена как обзорно-ознакомительная и представляет собой компиляцию материалов без ссылок и излишних нагромождений научной информации для общего ознакомления подписчиков и читателей всех уровней вовлеченности в тематику пробиотиков, для понимания и расширения кругозора в этой уникальной области и конечно для популяризации пробиотиков в современном сельском хозяйстве! Представленная статья открывает цикл статей, посвященных бактериям, входящим в состав пробиотика ЛАКТОПИОН. В следующих публикациях будут изложены другие интересные материалы о Propionibacterium freudenreichii, а также увлекательные факты из мира микробиологии и конечно статьи, касающиеся других представителей пробиотических биопрепаратов и кормовых добавок.
Читайте наши публикации. С Уважением к Вам к.б.н., доцент, микробиолог Шестаков Андрей Геннадьевич.