Эта публикация отражает содержание доклада «Ошибки при разработке ВЭЖХ-методик, от которых будут страдать все», прочитанного на мультиконференции «Диаэм» 9 ноября 2022 года.
Заместитель заведующего лабораторией физико-химических методов анализа Томского государственного университета Дмитрий Кургачев об ошибках хроматографического анализа, встречающихся у пользователей.
Почему обзор ошибок в хроматографии — это важно?
Начнем с того, что примерно так выглядит любая методика, описанная в нормативной документации, по сравнению с результатами ее применения в реальности.
Поэтому появляются высказывания и диалоги, подобные этим:
- «...я вчера даже поплакала у хроматографа»,
- «— Мы не можем заменить, методики зарегистрированы и отвалидированы — Ну поздравляю, вы сами себе злобные буратины, значит. — Увы, мы их не разрабатывали... и теперь нам только мучиться с ними придется. — А зачем там [название типа сорбента и колонки]? — Да кто его знает. Дали готовую отвалидированную методику и сказали: делайте. Там вообще прописана [название колонки]. Мы взяли […]. Поначалу все четко проходило по пригодности, а сейчас унылость. И заказать-то колонки стало проблемой...»
Специалисты ЛФХМА ТГУ каждый день сталкиваются с такими ситуациями и потому разработали «свод» типичных ошибок, встречаемых при экспертизе методик или при разработке их заново.
Работа на силикагелях при pH > 7
Первая типичная ошибка — использовать колонку на основе силикагеля при работе с pH больше 7. А ведь силикагель — это кремниевая кислота, и если кислоту постоянно промывать раствором щелочи, то происходит образование растворимой соли, которая благополучно выходит из колонки.
В итоге получаются колонки, выглядящие подобно изображенной на слайде — ее эксплуатировали при pH = 10. Силикагеля там в принципе не видно. После применения градиентных методик в колонках высотой 10 см бывает 5 см пустоты, но они при этом как-то еще работают.
Пользователь может спросить: «Но есть же колонки, в инструкции к которым написано, что они могут работать в щелочных средах?» Речь о разрекламированных бридж-этиленгибридных (технология Ethylene Bridged Hybrid [BEH]) сорбентах от Waters, Phenomenex, Gemini — в паспортах на такие колонки действительно написано, что они работают при pH до13...14.
Но эти сорбенты изготавливаются как силикагель, у которого на поверхности пор «высаживается» что-то похожее на органосилан — силикон. И это должно быть стабильно в щелочных средах. Но это все равно силикагель! Он замечательно, но недолго работает в щелочных средах, однако быстро деградирует, упаковка просаживается, эффективность быстро теряется.
А значит, если есть необходимость все-таки работать с высокими уровнями pH, стоит подумать еще раз. В фармацевтической отрасли по крайней мере автор доклада ни разу в жизни не встречался с ситуациями, требующими обязательной работы в щелочных средах, то есть с высокими pH. Впрочем, в индустриальной химии действительно есть такая потребность, есть вещества, которые быстро деградируют в кислых средах, но вот в «фарме» подобные ситуации — это редкость, экзотика.
Если все-таки такая потребность у аналитика есть, нужно работать на специальных колонках — не на основе силикагеля: в документации на колонку должно быть указано, что силикагель в ней не используется.
Примеры таких колонок — с ODP-50 (октадецилполивиниловый спирт) от Shodex Asahipak, PGC (porous graphitic carbon) — одним словом, в них не должно содержаться силикагеля. В документации к этим изделиям указан честный диапазон кислотности, в котором они нормально работают и ничего им при этом не будет.
Итак, не нужно работать в щелочной среде на силикагеле! Но следует и помнить, что все полимерные колонки всегда очень заметно хуже силикагеля, у них удельная эффективность гораздо ниже. А потому при возможности стоит работать на силикагеле, но подкислять пробу.
Ион-парная хроматография
О чем речь в этом разделе? О добавлении в подвижную фазу условного Fairy — мыла, ПАВ. При этом поверхность колонки «подзаряжается», к существующей обращенной фазе добавляется какой-то временный ионообменный механизм.
Для чего? Взглянем на некую абстрактную хроматограмму — например, полученную при разделении органических кислот вроде винной с примесями щавелевой, мезовинной, молочной и пр. Если смесь не делится, в подвижную фазу добавляют гидроксид тетрабутиламмония.
На колонке появляется положительный заряд, она становится слабым ионообменником, удерживание становится лучше, теперь можно достичь разрешения до базовой линии. Казалось бы, задача решена.
Но при таком подходе:
- Теряется чувствительность. Все «ион-парники» в УФ детекторе имеют остаточное поглощение, так что чувствительность всегда будет хуже.
- Все реагенты для ион-парной хроматографии дорогие: к примеру, 50 г гексансульфоната натрия стоят, как новая колонка.
- Методики с ион-парными реагентами всегда воспроизводятся хуже: если условно недосыпал, пересыпал, колонку недоуравновесил — всегда будет плохо, времена удерживания «плавают» очень сильно.
- Никакие масс-спектрометры, ELSD (испарительные светорассеивающие детекторы), никакую полупрепаративную хроматографию к таким методикам подключить не получится.
Если в препарате или образце будет примесь, пользователь никогда не поймет, что это за примесь, откуда она взялась, никогда никакой масс-спектр в таких условиях снять не получится.
К тому же эти добавки еще и сильно пенятся, вплоть до того, что в мерной колбе раствор не довести до метки.
Если же необходимо добавить ионообменный механизм к обращенно-фазовой хроматографии, то можно воспользоваться готовыми колонками, доступными для покупки, во всяком случае от «Диаэм». Например, какие-то из Acclaim Mixed WAX, Acclaim Mixed WCX, Scherzo SM-C18, Scherzo MS-C18, Sielc Primesep A, Sielc Primesep B, Helix Amaze SC, Helix Amaze TR, TCI Dual ODS-AX, TCI Dual ODS-CX и т. д.
Такие японские колонки стоят, как обычные С18, работают так же, плюс у них есть заряд. Есть и колонки с двумя зарядами — противоположными, регионально изолированными, и стоят они не так уж дорого.
Градиентная хроматография с ион-парным реагентом
Это третья группа ошибок, с которыми и сейчас сталкиваются эксперты.
Если кратко: скорее всего, ничего не получится даже на этапе разработки. Но даже если методика разработана, ее все равно практически никто не сможет повторить: когда методика уйдет в Минздрав и там они ее не смогут воспроизвести корректно, разработчик такой методики «получит страйк» от Минздрава.
Использование фармакопейной методики для субстанции при контроле качества лекарственного препарата
Это четвертое «комбо» и вообще что-то странное, но встречающееся в европейской фармакопее. Причем пользователи серьезно спрашивают: «но работает же!?»
Ион-парная хроматография
Пятый вид ошибок, встречающихся очень часто — и это очень серьезная методологическая ошибка!
Методики, описанные в фармакопее, написаны для субстанции. Но препарат — это не субстанция. И брать методику из европейской, американской или российской фармакопеи и использовать ее для контроля качества препарата нельзя.
Во-первых, фармакопейные методики уже невозможно улучшить: это уже неоднократно делали и все, что смогли, улучшили: все самое лучшее уже описано в фармакопейной статье, лучше уже не будет!
Во-вторых, в препаратах нужно контролировать другие примеси — чаще всего продукты распада или взаимодействия с матрицей. В субстанциях же примеси — это, как правило, соединения, оставшиеся от синтеза.
В-третьих, проблема состоит в том, что фармакопея существенно «отстает от человечества», в ее методиках нередко используются древние подходы и колонки старых типов, причем такие колонки часто еще и дороже современных.
Например, есть колонка Partisil (от Whatman), в которой силикагель используется даже не сферический, он «докиркландовской эпохи», то есть был разработан до 70 годов прошлого века и выпускается до сих пор! Причем на его основе в европейской фармакопее есть действительно много разработанных методик. Пользователи вынуждены покупать эти колонки, стоящие в три раза дороже, чем обычные какие-нибудь от Zorbax, и «живут» очень мало, но поскольку в фармакопее сказано, что их нужно использовать, значит, приходится приобретать именно их.
Но есть еще одно «маленькое» различие между субстанциями и препаратами с точки зрения хроматографии.
Какие примеси нужно контролировать в субстанциях? Признаемся честно, что хроматография больше особенно ни для чего и не нужна, кроме как контролировать примеси. Количественное определение работает хорошо, обеспечивается однородность, а проблема возникает обычно с примесями. И в субстанции нужно контролировать технологические примеси, деграданты, растворители, изомеры, катализаторы — в общем, все что не основное вещество в субстанции — это примеси.
А в препарате нужно контролировать только продукты распада в соответствии с ICH. Никакие технологические примеси, катализаторы и остаточные растворители в препарате контролировать не нужно, это в явном виде указано в законодательстве, потому что их уже проконтролировали на стадии субстанции!
В таком случае зачем использовать методику анализа, разработанную под примеси в субстанциях, для контроля нескольких продуктов распада в препарате? Это создает перерасход ресурсов, времени и сил.
«Культ карго в хроматографии»
Так можно описать шестую ошибку — как «культ даров с неба», суть которого лучше всего описывается картинкой «туземец сделал соломенный самолет, танцует вокруг него и ждет, что теперь с неба посыплются ящики с гуманитарной помощью».
То есть это идея пытаться бездумно что-то делать и рассчитывать, что из этого получится нечто хорошее. Ничего не получится, кроме траты впустую реактивов, времени и нервов. Вдобавок ко всему, еще и всем будет стыдно за такую методику.
Пример можно привести из европейской фармакопеи.
Лучшее, что в ней смогли сделать для контроля примесей в хлориде бензалкония (на период актуальности издания 11, 2022 г.), представлено методикой, в которой сам бензалконий вообще не выходит из колонки. Это не шутка, это лучшее, что смогли предложить разработчики. На хроматограмме видно примеси, они разбавленные!
Как не допускать классических ошибок в хроматографии?
А теперь о главном: как не допускать описанных выше ошибок?
Ответ прост: учить теорию. Хроматография — это наука теоретическая, кто бы что ни говорил о том, что это практическая область деятельности, в которой успех приходит с опытом. Нет! Хроматография — это теория и расчеты.
О том, как не совершать грубых ошибок, написано немало на сайте ЛФХМА ТГУ. Если же говорить о практике, то специалисты лаборатории читают немало практических курсов для сотрудников аналитических лабораторий, работающих на заводах и имеющих дело с хроматографией. Таких специалистов обучено более или около сотни, и пока никто не пожалел о том, что прошел это обучение.
Курсы, предлагаемые лабораторией, помогают систематизировать имеющиеся знания, получить прочную базу в хроматографических методах, выработать подходы к оптимизации разделений и обеспечении достоверности, усвоить особенности работы в ключевых режимах. Пока такие курсы проводятся только в Томске, не на выезде, но все вопросы обсуждаются.
Обучение проводится в открытых малых группах или по запросу предприятия. Курсы практические: больше половины времени занятий слушатели проводят, работая своими руками, и это значит, что стажеры получают практические навыки, которые можно применить в работе сразу после возвращения на свое предприятие.
Информацию обо всех курсах можно получить по приведенной ссылке http://lpcma.tsu.ru/education. Можно также обратиться лично к автору доклада, написав через сайт, на почту лаборатории или kurgachev.tsu@gmail.com.
Страница мультиконференции: 09.11.22. «Life Sciences, биотехнологии и аналитическая химия в современных условиях. Взгляд на Восток?»
Другие видео мультиконференции
- Аналитическая лаборатория в новых условиях. Взгляд на Восток - Александр Кучкин, «Диаэм»
- «Импортозамещение на марше. Раман-спектрометры и микроскопы в аналитике: рутина и исследования» - Владимир Кукушкин, «Фотон-Био»
- «Отказ от ультра-ВЭЖХ. Что купить на сдачу?» - Владимир Сидельников, лаборатория физико-химических методов анализа Томского ГУ
- «Особенности выбора климатических камер для фармацевтической и пищевой промышленности» - Елена Петросян, «Диаэм»
- «Подходы к исследованию образцов неизвестного состава» - Дмитрий Кургачев, лаборатория физико-химических методов анализа Томского ГУ