Репликация - (replicatio - повторение) это процесс самовоспроизведения молекул нуклеиновых кислот, обеспечивающий точное копирование генетической информации и передачу ее из поколения в поколение. В его основе лежит ферментативный синтез ДНК на матрице ДНК или РНК на матрице РНК (у РНК-содержащих вирусов).
До полной расшифровки структуры ДНК предполагалось три возможных механизма репликации её молекул:
1) Консервативный
Считалось, что новая дочерняя ДНК строится на двухцепочечной материнской молекуле и не содержит материал материнской ДНК
2) Полуконсервативный
Цепь ДНК раскручивается на две одиночные цепи, и на каждой материнской цепи строится вторая дочерняя цепь. В итоге каждая вновь синтезированная молекула ДНК гибридна, так как представлена одной материнской и одной дочерней цепью.
3) Дисперсный (дисперсивный)
Новая ДНК состоит из отдельных, чередующихся без определенной закономерности материнских и дочерних участков.
Модель Уотсона-Крика предполагала полуконсервативную репликацию. Этот механизм был доказан в 1957-58 г.г. американскими биохимиками Мезельсоном и Сталем.
Они выращивали клетки бактерии кишечной палочки на искусственной питательной среде, содержащей тяжелый изотоп азота 15 в виде хлорида аммония.
Затем клетки выделялись из данной среды и помещались в среду с обычным азотом азота 14.
После первого деления обнаружилось, что все молекулы ДНК оказались гибридными, то есть содержащими как изотоп азота 15, так и изотоп азота 14. После второго деления половина молекул ДНК из клеток оказалась гибридными, а половина только с изотоп азота 14.
В третьем поколении клеток соотношение молекул ДНК, состоящих из легкого азота, к гибридным составило 1:3.
Почти одновременно с этими экспериментами были получены данные о синтезе ДНК в искусственных условиях.
В 1956 году американский биохимик Корнберг выделил фермент, способный связывать свободные дезоксирибонуклеотиды в комплементарную цепь при наличии одиночной цепи ДНК и в присутствии АТФ. Он называется ДНК-полимераза. В последующих экспериментах вместо нуклеотидов и АТФ Корнберг использовал дезоксирибонуклеозидфосфаты. Было доказано, что нуклеотиды легче всего присоединяются к ДНК-матрице.
Когда нуклеозидфосфаты связываются друг с другом, две концевые фосфатные группы отщепляются, оставшаяся фосфатная группа нуклеотида и освобождающаяся энергия используются для образования эфирной связи с 5шрих и 3штрих атомами остатков сахаров соседних нуклеотидов. Расщепление пирофосфата осуществляет фермент пирофосфатаза. Синтез новой цепи всегда идет в направлении 5штрих - 3штрих: 3штрих - ОН концевого нуклеотида атакует альфа-фосфат очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата в том случае, если он комплементарен очередному нуклеотиду матрицы, а дезоксирибомонофосфат оказывается связанным фосфодиэфирной связью с растущей цепью ДНК, удлиняя ее на одно звено.
Синтез в направлении 5штрих - 3 штрих растущей полинуклеотидной цепи является характерной особенностью всех реакций матричного типа.
Полное название ДНК-полимеразы такое ДНК-зависимая ДНК-полимераза.
В ходе синтеза ДНК-полимераза проверяет комплементарность каждого нуклеотида матрицы дважды. Один раз в период включения его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется в том случае, если последний (3штрих-концевой нуклеотид) комплементарен матрице. Если же на предыдущей стадии полимеризации произошла ошибка, то репликация останавливается до тех пор, пока не будет удален неправильный нуклеотид. Некоторые ДНК-полимеразы обладают не только полимеризующей, но и 3штрих-экзонуклеазной активностью, которая отщепляет неспаренный с матрицей неправильный нуклеотид. После чего полимеризация восстанавливается. Разные ДНК-полимеразы одного организма и ДНК-полимеразы разных организмов отличаются друг от друга.
Типы ДНК-полимераз.
1) Бактериальная ДНК-полимераза
ДНК-полимераза I.
Это ДНК-полимераза, выделенная Корнбергом. Выполняет следующие функции:
- удаление разных дефектов в ходе репарации ДНК и в случаях нарушения синтеза ДНК,
- удаление РНК-затравки, необходимой для синтеза ДНК, достройка фрагментов Оказаки.
Этот фермент, помимо 3шрих-экзонуклеазной активности, обладает еще и 5штрих-экзонуклеазной активностью.
ДНК-полимераза II.
Обладает 3штрих-экзонуклеазной активностью. Основная функция - участие в репарации. В отсутствие ДНК-полимеразы I достраивает фрагменты Оказаки.
ДНК-полимераза III.
Это главный фермент репликации, обладающий полимеризующей активностью. Обладает также и 3штрих-экзонуклеазной активностью.
При оптимальных условиях скорость синтеза составляет около 1000 нуклеотидов в секунду.
2) Эукариотическая ДНК-полимераза
ДНК-полимераза Альфа
Основной фермент ядерной репликации.
ДНК-полимераза Бетта
Играет главную роль в репарации ДНК.
ДНК-полимераза Гамма
Осуществляет синтез ДНК митохондрий.
ДНК-полимераза Дельта
Обладает 3штрих-экзонуклеазной активностью и имеет функции, аналогичные ДНК-полимеразе I бактерий.
Молекулярные основы репликации ДНК.
Репликация ДНК является матричным процессов и, как любой матричный процесс, обызательно включает три основные стадии:
1. Инициация (начало синтеза)
2. Элонгация (наращивание цепи)
3. Терминация (окончание стадии)
Репликация является сложным процессом и для ее осуществления необходима работа более чем 20 различных ферментов. Лучше изучен механизм репликации прокариот. Рассмотрим это на примере кишечной палочки.
Инициация.
Для начала синтеза цепи ДНК требуется затравка (небольшой участок молекулы РНК - 10 н.о. - РНК-затравка или праймер). она необходима для работы ДНК-полимераз, так как они не могут связываться со свободными несоединенными с матрицей нуклеотидами. РНК-затравку синтезирует фермент - РНК-полимераза или праймаза. Для работы любых РНК-полимераз не требуется затраки, а необходимо присутствие в цепи ДНК специфического участка - промотора. Праймаза у бактерий является отдельным ферментом, а у эукариот входит в состав ДНК-полимеразы Альфа в качестве субъединицы.
К РНК-затравке ДНК-полимераза присоединяет дезоксирибонуклеотиды, начиная синтез комплементарной цепи ДНК. После того, как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравка удаляется и оставшиеся бреши застраиваются ДНК-полимеразой.
Так как молекула ДНК двухспиральна, то перед репликацией ее матричные цепи должны быть разделены. Расплетание осуществляют 2 АТФ-зависимых фермента - хеликазы. Движимая энергией гидролиза хеликаза едет однонаправленно по одной из цепей, расплетая перед собой двойную спираль. Одна хеликаза идет от 5штрих-конца к 3штрих-концу матричной цепи ДНК, а другая в обратном направлении. Так как цепи ДНК антипараллельны, то движение хеликаз происходит с одну сторону. В результате образуется репликативная вилка. Формированию репликативной вилки способствуют и другие специфические белки. Это SSB-белок или ДНК-связывающий белок. Этот белок связывается с цепью ДНК, расправляет ее, препятствует связыванию между собой раскрученных цепей ДНК и активирует ДНК-полимеразу.
Элонгация.
Наращивание цепи ДНК осуществляет ДН-полимераза III. Для своей работы ДНК-полимераза нуждается в наличии свободного 3штрих-конца материнской цепи ДНК. Так как одиночные цепи одной и той же молекулы ДНК антипараллельны, а следовательно такая раскрученная молекула может иметь только один свободный 3штрих-конец, то непрерывный синтез происходит только по одной материнской цепи ДНК с образованием ведущей или лидирующей дочерней цепи ДНК. На другой материнской цепи синтез запаздывающей дочерней цепи ДНК происходит в обратном направлении короткими фрагментами. Это явление открыл Оказаки. Поэтому участки ДНК, синтезируемые на запаздывающей цепи называют фрагментами Оказаки. Предварительно материнскую цепь расплетают две хеликазы: Rep хеликаза (для синтеза лидирующей цепи) и DNA B хеликаза (в составе праймосомы - хеликаза+праймаза) расплетает материнскую цепь для синтеза запаздывающей цепи.
ДНК-полимераза III едет по одной из матричных цепей в направлении раскрывания репликативной вилки и синтезирует ведущую цепь. По другой матричной цепи в том же направлении идет праймосома. Время от времени входящая в состав праймосомы праймаза синтезирует РНК-затравки для запаздывающей цепи. Вторая молекула ДНК-полимеразы III удлиняет эти затравки до тех пор, пока не упрется в предыдущую затравку, то есть синтезирует фрагменты Оказаки. Затем действует ДНК-полимераза I, которая продолжает удлинять фрагменты Оказаки, одновременно гидролизуя РНК-затравку предыдущего фрагмента, используя свою 5штрих-экзонуклеазную активность. После действия ДНК-полимеразы I между двумя соседними фрагментами остается только одноцепочечный разрыв, который «зашивает» еще один тип фермента ДНК-лигаза.
Терминация.
Она изучена пока недостаточно. Предполагают, что прекращение репликации ДНК программируется особой нуклеотидной последовательностью. В том числе в виде специальных палиндромов, то есть участков ДНК с множественными повторами.
Особенности репликации у эукариот.
Эукариотические геномы значительно больше бактериальных, а скорость синтеза ДНК у эукариот значительно ниже (несколько десятков нуклеотидов в секунду).
Поэтому инициация синтеза ДНК эукариот происходит одновременно во многих точках хромосомы, то есть хромосомы имеют полирепликационную организацию. Размер репликона у эукариот около 100 тыс н.о. Инициация репликации происходит не на случайных последовательностях, а на вполне определенных участках ДНК, называемых ориджины (ori - последовательности).
Инициация репликации строго регулируется: в каждом цикле клеточного деления каждый ориджин должен сработать только один раз, в противном случае образуется разветвленная структура. Запрет на повторную репликацию существует лишь в одном и том же цикле клеточного деления, в ходе митоза он снимается.