Первую часть можно почитать по ссылке: https://dzen.ru/a/aUV3ZWsLy3IHpCsD
Вторую часть можно почитать по ссылке: https://dzen.ru/a/aUatk_1QE22upC66
Как и обещал, в этом выпуске я расскажу о методах, которые позволили «преодолеть» дифракционный предел Аббе
Предыстория
В 2014 году Нобелевская премия по химии вручена «за разработку сверхразрешающей микроскопии» и за преодоление, казалось бы, нерушимого дифракционного барьера. «Нормальным» путем дифракционный барьер действительно не преодолеть: это физика. Но с помощью некоторых ухищрений решить задачу все-таки можно. Основной идеей здесь является использование флуоресцентных молекул (таких как широко применяемые в молекулярной биологии флуоресцентные белки), которые не просто отражают или рассеивают свет, а переизлучают его, причем делают это на уровне отдельных молекул. Этот переход — знание о том, что видимое в микроскоп 0.2-микрометровое световое пятнышко создается на самом деле единичной молекулой или очень небольшим их количеством — и лежит в основе увеличения разрешения за пределы дифракционного барьера. Развитие сверхразрешающих методик шло по нескольким параллельным направлениям, поэтому и «нобелевка» разделена на три равные части: немцу Штефану Хеллю и американцам Эрику Бетцигу и Уильяму Мернеру.
Этап I. STED микросокпия
Штефан Хелль с самой аспирантуры, законченной в 1990-м году в Гейдельберге (Германия), мечтал обойти дифракционный барьер. Однако более мастистые ученые воспринимали эту идею с отчетливым недоверием, и Хелль уехал работать в университет Турку (Финляндия) в лабораторию, занимавшуюся флуоресцентной микроскопией. Вспышка света, указавшая дорогу к заветной мечте, сверкнула в голове исследователя, когда тот, утомленно перелистывая талмуд под названием «Квантовая оптика», наткнулся на словосочетание «вынужденное излучение» (stimulated emission). Это стало ключом к новой методике, за которую Хелль и удостоился Нобелевской премии — микроскопии, основанной на эффекте вынужденного гашения флуоресценции (STED — stimulated emission depletion).
В «традиционной» флуоресцентной микроскопии исследователь наблюдает распределение в клетке флуоресцентно-меченных веществ (например, антител), свечение которых индуцируется лазерным лучом определенной длины волны. В STED-микроскопии техника усложнена за счет второго лазерного луча, вызывающего вынужденное гашение флуоресценции образца (да, есть и такой эффект) (рис. 1). Причем происходит это не по всему образцу сразу, а только в небольшой его области порядка десятков нанометров, как бы выхватывая ее из тьмы. Особенность этой системы в том, что гасящий импульс кольцом охватывает возбуждающий, заставляя флуоресцировать фрагмент образца, находящийся уже в субдифракционном диапазоне. А это и есть сверхразрешение. Статья [1].
Нельзя сказать, чтобы статья сразу «выстрелила», но нужные люди ее заметили, и Хелля пригласили работать в Институт биофизической химии им. Макса Планка в Гёттингене (Германия), где он довел методику до ума, и в 2000-м году представил публике рабочую версию, позволившую получить изображения живых клеток с разрешением, в три–шесть раз превосходящим пресловутый дифракционный барьер [2] (рис. 2).
Этап II. Микроскопия на одиночных молекулах
Начало
В отличие от STED-микроскопии, концепция, разрабатывавшаяся двумя другими лауреатами премии 2014 года — Эриком Бетцигом и Уильямом Мернером, — основана на регистрации флуоресцентного сигнала от одиночных молекул с последующим совмещением в единое изображение. Вообще говоря, это серьезное достижение — увидеть отдельную молекулу, ведь в стандартных физико-химических методах (спектроскопия, флуоресценция и т.д.) ученые получают усредненный сигнал от примерно миллиардов миллиардов молекул. Тем весомее результат Уильяма Мернера, который еще в 1989 году впервые добился этого [3].
В 1997 году Мернер перешел на работу в Университет Калифорнии в Сан-Диего (США), где будущий нобелевский лауреат Роджер Тсин работал с флуоресцентными белками (ФБ), пытаясь расширить их спектр от исходного зеленого до полной радуги. Мернер присоединился к исследованиям и обнаружил, что флуоресценция некоторых из этих белков является фотоуправляемой — при освещении ФБ светом определенной длины волны флуоресценция «выключалась», а после использования исходного света — восстанавливалась. «Растащив» молекулы ФБ в геле, чтобы они гарантированно располагались там по одному (с расстоянием между молекулами больше 0.2 мкм), он продемонстрировал регистрацию и управление одиночными молекулами, что стало весьма впечатляющим достижением [4].
Развитие
Эта технология стала тем, чего так не хватало Эрику Бетцигу. В начале 1990-х работал в исследовательском центре Bell Labs в Нью-Джерси (США), занимаясь микроскопией ближнего поля, которая, с одной стороны, дает разрешение лучшее, чем обычная оптическая микроскопия, а с другой — накладывает слишком строгие ограничения на образец и вообще обладает массой недостатков.
Несмотря на то, что поэзия зрелых исканий тогда уже требовала от Бетцига смены обстановки исследовательской лаборатории на что-нибудь более динамичное, он, как и другие персонажи этой истории, был буквально одержим идеей преодоления дифракционного барьера. И вот, перед тем как в 1995 году все-таки бросить исследования на долгие годы, Бетциг публикует свои соображения об одновременном использовании флуоресцентных меток нескольких цветов и совмещении получающихся изображений для увеличения разрешения метода [5].
...Прошло 10 лет. Карьера в бизнесе так и не принесла Бетцигу успокоения и не освободила его от мыслей о дифракционном барьере. И вот наконец он наткнулся на идею флуоресцентных белков, которые могут пометить любые клеточные компоненты, а также управляться светом. Ключевой идеей, которой ему не хватило за десятилетие до того, стало то, что не нужны метки разных цветов. Нужны просто метки, активирующиеся в разные моменты времени (рис. 3). Высокое разрешение достигается за счет регистрации положения части флуоресцентных меток, после чего, повторив измерение много раз, можно восстановить полную картину и достичь высокого (субдифракционного) разрешения.
Итог
Всего через год была опубликована работа, ставшая завершающей в этом нобелевском цикле [6]. Новый принцип, названный PALM-микроскопией (Photoactivated localization microscopy), был использован для получения детальной картины мембраны лизосомы, меченной флуоресцентным белком (рис. 4). Принцип состоит в том, чтобы вследствие использования слабого возбуждающего импульса лишь часть молекул ФБ активировалась и начинала светиться, причем чтобы статистически эти молекулы оказывались на расстоянии, большем дифракционного предела. Регистрируемая при этом картина состоит из редких светящихся точек, но зато про каждую известно, что это отдельная молекула, что многократно повышает разрешение. Спустя какое-то время свечение проходит, и новый импульс активирует уже другой набор молекул ФБ. Накопление и совмещение достаточно большого количества таких кадров позволяет провести очень качественную реконструкцию, эффективное разрешение которой существенно превышает ограничение, наложенное дифракционным пределом.
Эпилог
Все трое ученых продолжают активно заниматься исследованиями. Созданные лауреатами методики, по праву получившие название «наноскопия», продолжают активно использоваться учеными в лабораториях всего мира. Вот как комментирует вручение Нобелевской премии Алексей Пахомов, научный сотрудник группы химии хромопротеинов Института биоорганической химии (ИБХ) РАН: «Субдифракционная микроскопия позволяет на порядок повысить разрешение флуоресцентных микроскопов с нескольких сотен до нескольких десятков нанометров. Часто эту технологию так и называют — микроскопия суперразрешения».
Интересно, что с момента появления первых суперразрешающих микроскопов до вручения Нобелевской премии прошло не так много времени: первые экземпляры появились всего около 10 лет назад. Это тот редкий случай, когда очевидность пользы изобретения быстро становится понятной даже для Нобелевского комитета. К примеру, Нобелевский лауреат по химии 2008 г., О. Шимомура, открывший зеленый флуоресцентный белок (GFP), опубликовал свое открытие еще в начале 1960-х гг.
Отдельно хочется отметить вклад российских ученых в развитие этой технологии. Использование флуоресцентных белков для получения субдифракционных изображений живых клеток методом PALM (разработка Бетцига [6]) стало возможным благодаря явлению фотоактивации, открытому в лаборатории С.А. Лукьянова ИБХ РАН [7].
Написано по мотивам пресс-релиза Нобелевского комитета [8].
1. Hell S.W., Wichmann J. (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782;
2. Klar T.A., Jakobs S., Dyba M., Egner A., Hell S.W. (2000). Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8206-8210;
3. Moerner W.E., Kador L. (1989). Optical detection and spectroscopy of single molecules in a solid. Phys. Rev. Lett. 62, 2535-2538;
4. Dickson R.M., Cubitt A.B., Tsien R.Y., Moerner W.E. (1997). On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature 388, 355-358;
5. Betzig E. (1995) Proposed method for molecular optical imaging. Opt. Lett. 20, 237-239;
6. Betzig E., Patterson G.H., Sougrat R., Lindwasser O.W., Olenych S., Bonifacino J.S., Davidson M.W., Lippincott-Schwartz J., Hess H.F. (2006). Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642-1645;
7. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S., Verkhusha V.V. (2005). Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 885–891;
8. Пресс-релиз Нобелевского комитета: The Nobel Prize in Chemistry 2014.
Львиная доля материала взята отсюда: biomolecula.ru/articles/p...
(Статья автора: Чугунова Антона)