С тех пор, как Росс Гренвилл Харрисон успешно вырастил нейробласты in-vitro в 1907 году, исследования клеточных культур внесли огромный вклад в развитие медицины. Несмотря на это, фундаментальные технологии и методы оставались в основном неизменными на протяжении большей части прошлого века.
Однако в последние годы достижения в области исследований клеточных культур привели к настоящему "культурному" ренессансу, если можно так выразиться. Одной из технологий, делающих это возможным, является стереолитографическая (SLA) 3D-печать. Также известная как аддитивное производство, 3D-печать может помочь исследованиям клеточных культур перейти в новую эру более точных и реалистичных экспериментов, одновременно снижая затраты и время на разработку и открывая двери для создания более новых и сложных геометрий.
Эта статья сначала опишет, что такое клеточные культуры, как традиционно проводятся исследования и как технология 3D-печати меняет отрасль. Вы узнаете:
- Основные типы устройств для клеточных культур, создаваемые сегодня.
- Множество преимуществ, которые 3D-печать привносит в создание устройств для клеточных культур.
- Простой пошаговый процесс 3D-печати клеточных культур.
В центре внимания пионеров
Росс Гренвилл Харрисон
Росс Гренвилл Харрисон был американским зоологом, который разработал первые успешные культуры животных тканей и стал пионером трансплантации органов. В свой первый год работы в качестве профессора сравнительной анатомии и биологии в Йельском университете (1907–38 гг.), где он также занимал должность заведующего кафедрой зоологии, Харрисон культивировал ткань головастика и обнаружил, что из неё растут нервные волокна. Он наблюдал, что отростки нервных клеток демонстрируют протоплазматическое движение, разрешив спор о формировании и природе нервных волокон. Его наблюдения заложили основу современной физиологии и неврологии нервной системы, а его техника культивирования сыграла ключевую роль в разработке вакцин против рака и полиомиелита.
Что такое клеточная культура? Убираем путаницу
На самом базовом уровне культура клеток относится к технике, при которой клетки извлекаются из животного или растения и выращиваются в тщательно контролируемой in-vitro или искусственной среде. Клетки могут быть удалены из ткани напрямую или разделены с помощью ферментов или механических процессов, либо они могут быть взяты из уже установленной клеточной линии или штамма. Базовые требования для культивирования клеток — это первичные клетки, место для размножения, питательная среда, обеспечивающая необходимые питательные вещества, и подходящая среда.
Основные цели культивирования клеток — разработка новых фармацевтических препаратов или проведение исследований биологических систем. Ожидается, что к 2027 году индустрия культивирования клеток станет рынком стоимостью 45 миллиардов долларов.
Применение клеточных культур обширно и разнообразно. Они играют ключевую роль в разработке новых фармацевтических препаратов или методов лечения и оказали значительное положительное влияние на современное здравоохранение. Применение клеточных культур можно условно разделить на клинические и экспериментальные категории, как описано в таблице ниже.
Некоторые заметные лидеры на рынках техник, инструментов и патентов для культивирования клеток включают Merck, Thermo Fisher Scientific и Irvine Scientific.
Давайте рассмотрим оборудование, обычно встречающееся в лабораториях клеточных культур
Ниже перечислено общее оборудование, используемое учеными для разработки клеточных культур:
- Вытяжной шкаф (ламинарный бокс): Используется для поддержания чистой, асептической среды, свободной от загрязнений. Вытяжные шкафы также удаляют любые вредные агенты из воздуха.
- Инкубатор: Клетки выращиваются в инкубаторе, который контролирует уровень CO2, O2 и температуру для оптимального размножения клеток. Температура обычно поддерживается на уровне 37°C.
- Водяная баня: Теплая водяная баня используется для подогрева реагентов, чтобы при добавлении в культуру они не вызывали тепловой шок у клеток. Альтернативой водяной бане является баня с металлическими шариками.
- Центрифуга: Центрифуга используется для осаждения (пеллетирования) клеток и отделения их от реагентов.
- Холодильник: Холодильник используется для хранения реагентов, когда они не используются. Его также можно использовать для хранения замороженных клеток для последующего использования.
- Гемоцитометр: Используется для облегчения подсчета живых и мертвых клеток. Гемоцитометрия — это ручной процесс, тогда как машина для подсчета клеток может автоматизировать процесс подсчета.
- Микроскоп: Микроскоп используется для проверки культуры, чтобы убедиться, что она размножается, как ожидалось.
- Колбы для культивирования клеток: Используются для размещения клеточной культуры во время размножения. Также используются чашки Петри.
- Питательная среда: Питательная среда обеспечивает клетки необходимыми питательными веществами, позволяя им размножаться. Разные типы клеток требуют разных питательных сред.
- Реагенты: В клеточных культурах используется множество различных реагентов. Реагенты используются для диссоциации адгезивных клеток, а также для стерилизации колбы или чашки Петри.
- Пипетки: Пипетки используются для внесения соответствующих реагентов, клеток и питательной среды в колбы для культивирования клеток.
- Контейнеры для отходов: Все одноразовое оборудование, использованное во время экспериментов с клеточными культурами, должно быть безопасно утилизировано в специально маркированный контейнер для отходов.
3D-печать: Новое измерение в исследованиях клеточных культур
3D-печать, в частности SLA-печать, имеет множество различных преимуществ, которые влияют на создание клеточных культур. В этом разделе будут рассмотрены некоторые из более устоявшихся применений, а также выделены конкретные преимущества, предоставляемые 3D-печатью.
3D-печать способствует развитию науки о клеточных культурах через:
- Быстрое прототипирование: 3D-печать позволяет создавать множество итераций дизайна, размера, формы или сборки на основе результатов реальных испытаний и анализа, помогая быстрее воплощать в жизнь лучшие продукты. Это означает, что несколько конструкций могут быть изготовлены и протестированы параллельно, чтобы быстрее прийти к наилучшему возможному решению. 3D-печать дает исследователям возможность прототипирования в тот же день и гибкость для параллельной оценки нескольких вариантов дизайна.
- Свобода дизайна: Одно из величайших преимуществ 3D-печати, и особенно SLA-печати, — это возможность создавать сложные геометрии и конструкции, которые ранее были недоступны при традиционном производстве. Теперь исследователи имеют свободу проектировать эксперименты с более сложными и органичными геометриями и конфигурациями для своих приложений. Если вы можете это представить, есть довольно большая вероятность, что вы сможете это напечатать.
- Аналог человека: Хотя технически это относится к той же категории, что и свобода дизайна, возможность создания аналогов человека нельзя переоценить. От микрофлюидики и «органов-на-чипе» до бескаркасных 3D-клеточных культур, 3D-печать позволяет изготавливать сложные устройства для культивирования клеток, которые более точно отражают физиологию человека.
- Внутреннее производство: Лаборатории клеточных культур могут проектировать и производить компоненты собственными силами, не полагаясь на внешних поставщиков. Внутреннее производство готовых к использованию устройств становится обычным явлением в здравоохранении, будь то для устройств, специфичных для пациента, или для усиления цепочек поставок, возможность производить компоненты внутри компании обеспечивает большую гибкость и автономию.
- Низкая стоимость: 3D-печать устройств для клеточных культур значительно дешевле, чем традиционные методы производства, такие как литье под давлением, фрезерование на станках с ЧПУ и фотолитография для низких и умеренных объемов деталей.
- Разнообразие материалов: Количество материалов для 3D-печати быстро растет и предлагает исследователям больше возможностей для выбора, включая биосовместимые и стерилизуемые варианты. 3D-печать также позволяет разрабатывать пользовательские материалы для удовлетворения индивидуальных потребностей. Formlabs Medical активно инвестировала в создание собственной линейки биосовместимых смол, предназначенных для медицинских работников, которые ищут медицинские материалы для широкого спектра применений, где критически важны как механические характеристики, так и биосовместимость. Материалы из нашего семейства BioMed Resin разрабатываются и производятся на предприятии, сертифицированном по ISO 13485, и совместимы с распространенными методами дезинфекции и стерилизации. Мы вернемся к этой теме в следующем разделе статьи.
Применения 3D-печати: Новые исследовательские возможности
Существует пять основных областей применения, которые появились в сфере клеточных культур и наиболее часто используют 3D-печать. Это: клеточные каркасы (скаффолды), микрофлюидика, биореакторы, устройства для сбора образцов и лабораторная посуда. В этом разделе мы рассмотрим преимущества, которые каждое из этих применений получает с внедрением 3D-печати.
1. Каркасы (скаффолды) для 3D-клеточных культур
Чтобы воспроизвести сложные трехмерные структуры, встречающиеся в органических in-vitro средах, клеткам необходимы поддерживающие структуры, называемые каркасами или скаффолдами. В лабораторных условиях эти каркасы изготавливаются из пористого биосовместимого полимера. SLA 3D-печать может использоваться для создания форм для полимерного каркаса.
Чтобы создать форму для каркаса 3D-клеточной культуры, исследователь сначала определяет желаемую форму и печатает соответствующую негативную модель. Затем этот негатив используется для отливки силиконовой формы, которую можно использовать для формирования полимерного каркаса. Аналогичный процесс, включающий 3D-печатный мастер-модель, силиконовую форму и готовый полимерный продукт, показан ниже на примере изготовленной модели многоканального кровеносного сосуда.
2. Микрофлюидика и миллифлюидика
Микрофлюидика — это методика, используемая для создания точных, предсказательных моделей в субмиллиметровом масштабе, которые имитируют сложные биологические системы в их in-vivo средах, не нарушая их внутренних биологических взаимодействий. Эти микрофлюидные тестовые устройства также называют «органами-на-чипе», поскольку они могут имитировать базовые функции различных органов. Например, «легкое-на-чипе» может воспроизводить кровоток, воздушный поток и движение, испытываемое клетками легких. Это позволяет исследователям проводить эксперименты на тканях органов в реалистичных условиях без необходимости использования животных моделей.
Традиционные методы производства, такие как фотолитография, фрезерование на станках с ЧПУ и литье под давлением, могут использоваться для производства микрофлюидных чипов. Однако эти методы часто дороги и требуют много времени. Они также ограничены простыми и, как правило, неорганическими геометриями.
3D-печать может производить микрофлюидные чипы за доли времени и стоимости, а также позволяет создавать сложные геометрии при необходимости. В 3D-печатном микрофлюидном устройстве шероховатость каналов и место смешивания жидкостей можно контролировать и варьировать с точностью до микрона. Такая степень контроля позволяет исследователям тестировать большее количество конфигураций путей жидкости и тестировать их в тот же день.
Подобно микрофлюидике, миллифлюидика — это просто изготовление тех же устройств, но с каналами для жидкости миллиметрового масштаба. Миллифлюидные устройства менее сложны в производстве и могут использоваться для широкого спектра применений. Вот несколько способов, с помощью которых миллифлюидика и микрофлюидика производятся с использованием 3D-печати:
- Закрытые каналы: В этом случае внутренние каналы печатаются непосредственно в жидкостном устройстве. Хотя это может быть успешно реализовано, это требует некоторых конструктивных соображений. Например, внутренние каналы, как правило, более успешны, когда ориентированы вертикально, а каналы, заканчивающиеся внутри жидкостного устройства, могут быть трудно правильно промыть во время постобработки.
- Открытые каналы: Проще, чем печать закрытых каналов, этот метод включает печать каналов на поверхности жидкостного чипа, который позже будет зажат между другими материалами, такими как PDMS. Основное соображение для этого метода — обеспечить, чтобы отпечаток оставался плоским и избегал коробления во время печати и/или постобработки.
- Формы для каналов: Вместо того чтобы печатать открытые или закрытые каналы непосредственно в отпечатке, этот метод включает печать позитивных элементов на поверхности отпечатка, которые позже будут использоваться в качестве формы для жидкостного устройства.
3. Биореакторы
Биореакторы — это устройства, которые поддерживают все условия окружающей среды, необходимые клеткам для эффективного размножения. Эти условия включают pH, подачу газа, температуру и питательную среду. Биореактор будет поддерживать все эти параметры при минимальном участии человека. 3D-печать позволяет создавать индивидуальные биореакторы, которые были оптимизированы специально для отдельного эксперимента. Примером этого является проектирование перфузионной системы, способной засевать адипогенные стволовые клетки в каркас-заменитель кости. Были спроектированы и напечатаны несколько различных конфигураций реактора для изучения различных вариантов биореакторов.
4. Устройства для сбора образцов
Puritan Medical Products в Мэне и Copan Diagnostics в Италии, два крупных поставщика назофарингеальных зондов, не могли удовлетворить спрос, когда COVID-19 охватил мир в 2020 году. Новаторы из Медицинской школы Морсани при Университете Южной Флориды обратились к 3D-печати, чтобы помочь заполнить образовавшийся пробел в цепочке поставок.
Они вместе с Northwell Health и Formlabs разработали первые массово производимые 3D-печатные зонды для сбора образцов. Зонды печатались на Form 3B с использованием полужесткой биосовместимой смолы. На сегодняшний день в шестидесяти разных странах было напечатано на 3D-принтере более 40 миллионов тестовых зондов на COVID-19.
Чтобы подчеркнуть влияние 3D-печати, в начале 2023 года USF Health, Northwell Health и Formlabs были удостоены награды «Патенты для человечества» (Patent for Humanity) от Ведомства по патентам и товарным знакам США (USPTO). С появлением 3D-печатных биосовместимых материалов увеличилось количество медицинских работников, непосредственно печатающих на 3D-принтере устройства для сбора образцов. Это могут быть контейнеры или зонды. 3D-печать зондов для COVID-19 была настолько успешной, что в 2023 году Ведомство по патентам и товарным знакам США присудило награду «Патенты для человечества» Университету Южной Флориды Health, Northwell Health, Госпиталю Тампа-Дженерал и Formlabs.
5. Лабораторная посуда
В дополнение к сложным микрофлюидным устройствам и биореакторам, 3D-печать также может использоваться для решения более обыденных, но важных задач в лаборатории клеточных культур. Примером этого является модификация традиционной конструкции планшета для культивирования (well plate) для включения различных геометрий перегородок (баффлов). Изготовление пользовательских баффлов традиционно является очень дорогим и трудоемким процессом. Однако с доступной и недорогой технологией 3D-печати реализация проектов по созданию пользовательской лабораторной посуды становится намного проще. Изображения ниже показывают стандартный планшет для культивирования по сравнению с пользовательским планшетом.
Проектирование устройств для клеточных культур для 3D-печати
При разработке 3D-печатных устройств для клеточных культур существует несколько передовых методов, соблюдение которых даст оптимальные результаты. Давайте подробнее рассмотрим, как выглядят лучшие практики для 3D-печати и клеточных культур.
Шаг 1: Дизайн
При проектировании устройств для клеточных культур важно понимать принципы DFM (Design For Manufacturing), направленные на снижение стоимости и сложности детали. Для деталей, изготовленных с помощью SLA-принтеров, следующие общие правила могут обеспечить высокое качество:
Детали можно проектировать в любом CAD-программном обеспечении. Затем эту CAD-модель можно сохранить в формате OBJ или STL для импорта в программу подготовки к 3D-печати Formlabs — PreForm. PreForm можно бесплатно загрузить, и она может автоматически генерировать поддержки и оптимальную ориентацию печати для вашей детали.
Программное обеспечение для подготовки к печати, или слайсер, разрежет модель на множество различных слоев. Каждый слой по сути представляет собой поперечное изображение детали, которое проецируется на платформу построения. Ориентация детали должна быть выбрана таким образом, чтобы обеспечить отток смолы от детали, одновременно оптимизируя размещение поддержек и сокращая общее время печати. К счастью, такие программы, как PreForm, оснащены автоматическими алгоритмами, которые настраивают макет, ориентацию и поддержки вашей печати, поэтому любой член вашей команды может успешно печатать без специальной подготовки.
Выбор материалов для 3D-печатных клеточных культур
Необходимо отметить, что многие смолы являются цитотоксичными, то есть они разрушают клетки. Это связано с различными пластификаторами, фотоинициаторами и другими выщелачиваемыми химическими веществами, которые могут присутствовать в материалах для печати. Некоторые материалы сертифицированы как биосовместимые, и, как таковые, важно использовать их, чтобы сами детали не оказывали негативного влияния на клеточные культуры. Материалы также должны быть термостойкими до 120°C, чтобы выдерживать паровую стерилизацию. Смолы Formlabs были оценены в соответствии со следующими стандартами биосовместимости:
- ISO 10993-1:2018: Биологическая оценка медицинских изделий — Часть 1: Оценка и испытания в рамках процесса управления рисками
- ISO 7405:2009/(R)2015: Стоматология — Оценка биосовместимости медицинских изделий, используемых в стоматологии
- ISO 18562-1:2017: Оценка биосовместимости дыхательных газовых трактов в медицинских приложениях — Часть 1: Оценка и испытания в рамках процесса управления рисками
Когда биосовместимые материалы недоступны или нежелательны, было показано, что специализированные покрытия, такие как парилен, обеспечивают эффективный барьер между клетками и деталью. Если используется для микрофлюидики, оптическая прозрачность необходима для проведения оптической микроскопии. Доступны оптически прозрачные, биосовместимые и термостойкие смолы.
Formlabs предлагает растущую библиотеку биосовместимых материалов как для SLS, так и для SLA печати. Для нашей линейки SLA-принтеров это включает:
- BioMed White Resin: непрозрачный белый материал для биосовместимых применений, требующих длительного контакта с кожей или кратковременного контакта со слизистой оболочкой.
- BioMed Black Resin: матовый черный материал, подходящий для применений, требующих высокой контрастности для визуализации, отличной четкости и гладкого качества поверхности.
- BioMed Amber Resin: жесткий материал для биосовместимых применений, требующих длительного контакта с поверхностью кожи или кратковременного контакта со слизистой оболочкой.
- BioMed Clear Resin: жесткий прозрачный материал, который также валидирован в соответствии с ISO 18562, что позволяет использовать его в газовых трактах в здравоохранении.
3D-печать вашего устройства для клеточных культур
После того как компонент для клеточных культур спроектирован и выбран оптимальный материал, можно начинать печать. Тип используемой машины повлияет на качество готовой детали и, следовательно, на качество эксперимента. Принтеры с возможной толщиной слоя в 50 микрон идеально подходят для печати сложных устройств для клеточных культур. Например, Form 3B+ от Formlabs может печатать с толщиной слоя 100 или 50 микрон, что позволяет принтеру переключаться между высокодетализированными устройствами для клеточных культур и любыми другими типами медицинских отпечатков, не требующих наивысшего уровня детализации.
Процесс 3D-печати в значительной степени автоматизирован, требуя проверок только в том случае, если принтер сообщил о какой-либо ошибке печати. SLA 3D-печать известна своим низким процентом неудач. После завершения печати деталь можно аккуратно снять с платформы построения.
Постобработка и завершающие этапы
После завершения печати деталь должна пройти несколько этапов постобработки, перечисленных ниже:
- Удаление поддержек: Первый шаг — удаление поддержек острым бокорезом. Чем ближе срез к детали, тем лучше. Это сокращает объем последующей шлифовки.
- Промывка и пост-отверждение: После удаления поддержек деталь необходимо промыть изопропиловым спиртом для удаления любой неотвержденной смолы. После высыхания детали можно подвергнуть УФ пост-отверждению. Во время процесса промывки необходимо соблюдать осторожность, чтобы не сломать чувствительные элементы, так как деталь все еще относительно хрупкая перед отверждением. Может быть целесообразно использовать шприц, наполненный изопропиловым спиртом, для впрыскивания чистящей жидкости во внутренние каналы вашего отпечатка.
- Шлифовка: Шлифовка — это важный шаг не только для улучшения внешнего вида детали, но и для повышения оптической прозрачности. Начиная с наждачной бумаги зернистостью 3000, аккуратно отшлифуйте деталь и увеличивайте зернистость на 200, пока не будет достигнута желаемая отделка или не будет достигнута зернистость наждачной бумаги 12000. Прозрачные спреи-покрытия также можно использовать для увеличения оптической прозрачности без необходимости обширной шлифовки. Однако при использовании спреев-покрытий необходимо соблюдать осторожность, так как они могут быть цитотоксичными.
- Стерилизация: При работе с клеточными культурами важно стерилизовать деталь, чтобы исключить возможность создания цитотоксичной среды. Обычно это делается с помощью паровой стерилизации при 120°C в течение 20 минут при поддержании давления в 2 бара.
Formlabs предлагает 3D-принтеры и материалы мирового класса, которые могут стать сильным мультипликатором в любой лаборатории клеточных культур. Принтеры и материалы Formlabs успешно использовались во многих различных приложениях для культивирования клеток. Чтобы узнать больше о том, как Formlabs может помочь вашим исследованиям и разработкам в области клеточных культур, свяжитесь с представителем.
О нашей компании
TITAN 3D - поставщик и системный интегратор оборудования для 3D-печати, 3D-сканирования и автоматизированного контроля в промышленности, машиностроении, медицине.
Готовы ответить на все Ваши вопросы, проконсультировать по оборудованию, и подобрать лучшее оборудование для решения Ваших задач.
Каталог 3D-принтеров мировых производителей - проработку технологии, подбор оборудования, внедрение, пусконаладку и обучение берем на себя!
+7 (952) 243-77-75 I 01@titan-3d.ru I www.titan-3d.ru