Как наиболее эффективно проводить культивирование эмбрионов при процедурах ЭКО. Существуют разные системы. С сравнением разных подходов можно ознакомиться в работе группы испанских исследователей. Они предлагают сравнить влияние стратегии культивирования без нарушения среды и последовательной стратегии на развитие эмбриона in vitro и клинические исходы в циклах интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ).
Растущий успех методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) отчасти объясняется постоянным совершенствованием методов и материалов, используемых для культивирования эмбрионов. Стабильность условий культивирования имеет решающее значение для правильного развития эмбрионов. Каждый этап, связанный с манипуляциями с эмбрионами, подвергает их резким колебаниям факторов окружающей среды, таких как температура, состав воздуха или pH, что непосредственно препятствует их развитию. В связи с этим были разработаны различные подходы, чтобы избежать ненужного открывания дверей и снизить потенциальные нарушения. Каждая лаборатория должна проектировать свою систему культивирования как единое целое, чтобы установить оптимальный протокол роста эмбрионов, который лучше соответствует ее экономическим и клиническим требованиям. Культивирование in vitro без вмешательства становится все более популярной стратегией благодаря двум инновациям. Во-первых, интегрированные системы покадровой съёмки (TLS) – инкубаторы, оснащённые встроенной оптикой – позволяют осуществлять непрерывный и дистанционный мониторинг эмбрионов. Это позволяет избежать извлечения эмбрионов для традиционной оценки, состоящей из морфологической оценки под оптическим микроскопом. Во-вторых, разработка одноэтапных питательных сред, способных поддерживать полное культивирование человеческих эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты, устраняет необходимость смены среды на 3-й день последовательных сред.
Использование TLS в сочетании с одноэтапными средами устраняет необходимость извлечения эмбрионов из инкубатора и максимально увеличивает информацию, которую мы можем получить от эмбрионов, включая наблюдение характеристик и событий, которые могли бы быть упущены при ограничении несколькими временными точками наблюдения, и вводит новое измерение в оценку эмбрионов с концепцией морфокинетики.
Хотя некоторые эмбриологи выступают за непрерывное культивирование, другие поддерживают использование настольных инкубаторов и последовательных сред как более физиологичный подход.
Многочисленные исследования пытались определить оптимальный
выбор как инкубаторов, так и питательных сред. Однако текущие систематические обзоры пришли к выводу, что нет существенных доказательств, подтверждающих, что какой-либо метод приводит к улучшению клинических результатов.
Тем не менее, изоляция влияния одной переменной от другой может быть не совсем осмысленной, поскольку они взаимосвязаны; стратегию культивирования следует оценивать как комплексный подход.
В данном исследовании авторы провели ретроспективное сравнение клинических результатов, полученных в одной клинике с использованием последовательной стратегии культивирования 1 (CS1, обычный настольный инкубатор, последовательные питательные среды и морфологическая оценка под оптическим микроскопом) и стратегии культивирования без воздействия (CS2, TLS, одноэтапная питательная среда и отбор эмбрионов с помощью TLS).
Авторы исследования подвергали оплодотворенные ооциты длительному культивированию с использованием одного из двух протоколов.
В эксперименте CS1 преэмбрионы культивировали индивидуально в чашках Петри в предварительно уравновешенных каплях среды для дробления (Sydney IVF Cleavage Medium, Cook Medical(72,6%)/ORIGIO Sequential Cleav, Cooper Surgical (20,1%)/G-1, Vitrolife, Гётеборг, Швеция (8,3%)) с покрытием лёгким минеральным маслом (FertiCult Mineral Oil, FertiPro, Beernem, Бельгия [30%]/Life Global LiteOil, Cooper Surgical [70%]). Эти когорты эмбрионов культивировали в настольных инкубаторах EC-6 (Astec, Фукуока, Япония), по два пациента в каждой камере. Оплодотворение оценивали через 17–20 часов после ИКСИ под оптическим микроскопом по наличию двух пронуклеусов и двух полярных телец. На 3-й день (64–72 часа) после оплодотворения клеточность и морфология эмбриона оценивали под оптическим микроскопом. Затем эмбрионы переносили в новые чашки Петри, содержащие среду для бластоцист (Sydney IVF Blastocyst Medium, Cook Medical/ORIGIO Sequential Blast, Cooper Surgical/G-2, Vitrolife; в той же пропорции, что и среда для дробления), и помещали обратно в тот же инкубатор для оставшегося культивирования. Оценку эмбрионов проводили исключительно путем оценки морфологии бластоцисты на 5-й и 6-й дни под оптическим микроскопом. Бластоцисты классифицировали от A до E в соответствии с рекомендациями Ассоциации по изучению биологии репродукции (ASEBIR) (50).
В CS2 преэмбрионы культивировали в одной из трёх TLS: Embryoscope (Vitrolife, Швеция), Embryoscopeþ (Vitrolife) или Geriþ (Genea Biomedx, Сидней, Австралия). Эмбрионы когорты помещали в специальные чашки Петри для соответствующего инкубатора. Все чашки Петри были подготовлены накануне с использованием среды Geri (Genea Biomedx; 89,9%) или Continuous Single Culture-NX Complete (FUJIFILM Irvine Scientific, Санта-Ана, Калифорния; 10,1%) и лёгкого минерального масла (FertiCult Mineral Oil, FertiPro (83%) / Life Global LiteOil, Cooper Surgical (17%)). Морфологию эмбрионов оценивали на 3, 5 и 6 дни с помощью удаленной платформы каждого инкубатора (Embryo-Viewer для Embryoscope и Embryoscopeþ и Geri Connect и Assess 2.0 для Geriþ). Отбор эмбрионов проводился на основе иерархической комбинации морфологической оценки (ASEBIR) и доступного автоматического/полуавтоматического программного обеспечения в каждой TLS: KIDScoreD5 (Vitrolife) для Embryoscope и Embryoscopeþ (51) и Eeva Test (Merck, Дармштадт, Германия) для Geriþ (52).
Все результаты исследования оценивались по каждому циклу ИКСИ. Первичными результатами были частота живорождения (LBR) после свежего SET и кумулятивная ЧЖ после всех переносов замороженных-размороженных эмбрионов, выполненных в течение 1 года. Вторичными результатами на уровне развития эмбриона (рассчитываемыми по количеству правильно оплодотворенных эмбрионов) были частота формирования бластоцисты к 5-му дню и к концу культивирования, доля эмбрионов, отнесенных к категории A или B (две верхние категории) по морфологическим критериям ASEBIR для оценки бластоцисты, и частота использования (бластоцисты достаточного качества для переноса или витрификации).
Другие клинические результаты были представлены как вторичные: доля циклов, завершившихся без жизнеспособного эмбриона, частота клинической беременности, частота продолжающейся беременности (OPR) и частота выкидышей (самопроизвольной потери беременности) после свежего SET. Кроме того, были также представлены кумулятивная частота клинической беременности, кумулятивная OPR и кумулятивная частота выкидышей, включая все эмбрионы, перенесенные в течение периода наблюдения 1 год. Хотя результаты переноса свежих эмбрионов направлены на оценку стратегии культивирования вместе с критериями отбора, используемыми в каждой стратегии, кумулятивные результаты предназначены для сравнения полного потенциала когорты эмбрионов. Наконец, также была представлена расчетная кумулятивная вероятность достижения первого живорождения при последующих неудачных циклах переноса на процедуру стимуляции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
После рассмотрения всех критериев включения и исключения в окончательный анализ было включено 4564 цикла ИКСИ: 1463 с ооцитами пациенток и 3101 с донорскими ооцитами. Соотношение двух видов лечения отражает реальный контекст испанских частных клиник лечения бесплодия, что также связано с большим количеством исключенных циклов ПГТ-А (1634 цикла в CS1 и 1210 в CS2). Анализ результатов оценивался отдельно для циклов со спермой пациентов и донации ооцитов.
Все результаты (доля эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты к 5-му дню и к концу культивирования (5-й или 6-й день), доля эмбрионов, классифицированных как A или B по критериям ASEBIR, и показатель использования) были выше в группе CS2. Доля циклов, завершившихся отсутствием жизнеспособной бластоцисты, не была достоверно связана со стратегией культивирования в исследованных моделях. Эти циклы составляли очень небольшую долю начатых циклов (7,7% аутологических циклов и 3,3% циклов донации ооцитов в группе CS2), что, хотя и является положительным показателем эффективности стратегий культивирования, затрудняет возможность обнаружения статистически значимых различий.
Была выявлена значимая положительная связь между использованием CS2 по сравнению с CS1 и основным результатом исследования, LBR, а также частотой наступления беременности и частотой продолжающейся беременности после первого переноса эмбрионов. Хотя приблизительная частота выкидышей была ниже при использовании CS2 в подгруппе доноров ооцитов, исследуемая модель не показала значимой связи между использованной стратегией культивирования и частотой выкидышей в каком-либо из циклов.
При сравнении кумулятивных результатов всех переносов, полученных из когорты эмбрионов в течение 1 года, результаты различались в зависимости от источника ооцитов. В аутологичных циклах не было обнаружено никакой связи между стратегией культивирования и ни одним из кумулятивных результатов. Однако в циклах донации ооцитов кумулятивный показатель OPR и кумулятивный показатель LBR были значительно выше в CS2, чем в CS1. Исследуемая модель также подтвердила связь между CS2 и более низкой кумулятивной частотой выкидышей в циклах донации ооцитов. Для оценки смешивающего фактора наличия нескольких марок сред и нескольких моделей инкубаторов были сравнены показатели LBR и кумулятивный показатель LBR циклов, выполненных с использованием каждого варианта.
Кумулятивная вероятность достижения живорождения на последовательный перенос в обеих стратегиях культивирования демонстрирует более положительную тенденцию при использовании CS2 в обоих типах циклов, хотя она более выражена в циклах донации ооцитов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Несмотря на количество опубликованных исследований, сравнивающих системы непрерывного и последовательного культивирования, до сих пор не существует консенсуса в пользу превосходства одного из них. Данные, полученные в этом исследовании, показывают улучшение клинических результатов при использовании системы непрерывного культивирования, особенно в циклах донации ооцитов.
Это одно из крупнейших одноцентровых исследований, оценивающее эффект полностью непрерывного культивирования. Непрерывное культивирование представляет собой не только стратегию для потенциального улучшения результатов, но и способ упрощения работы в лаборатории. Исключая необходимость в смене культуральных сред, можно снизить затраты на взаимозаменяемость, поскольку требуется только одна чашка и одна капля среды. Непрерывное культивирование также минимизирует необходимое количество этапов манипуляций, снижая стресс при работе и вероятность человеческих ошибок. Следовательно, даже если бы оба типа культивирования выполнялись одинаково, непрерывное культивирование все равно было бы предпочтительным вариантом, учитывая его дополнительные преимущества. Однако эта стратегия культивирования вызвала некоторые опасения, связанные с накоплением токсичных соединений.
Длительное культивирование без смены среды может привести к повышению осмоляльности, если испарение не контролируется, и накоплению токсичных побочных продуктов метаболизма, таких как аммоний, потенциально вредных для эмбрионов. Тем не менее, согласно полученным результатам, непрерывное культивирование поддерживает развитие эмбрионов аналогично или немного лучше, чем противоположная стратегия, поскольку даже при отсутствии различий на уровне развития эмбриона кумулятивные результаты когорт были улучшены.
Другие группы предположили, что условия культивирования могут влиять на плоидность эмбрионов, при этом мнения относительно непрерывного культивирования противоречивы. В частности, считается, что хромосомный мозаицизм в основном обусловлен лабораторными условиями. Однако недавнее исследование не обнаружило никаких различий в частоте эуплоидии и мозаицизма в когортах эмбрионов, культивируемых с использованием последовательных и одноэтапных сред, что подтверждает безопасность данной стратегии культивирования. Целью данного исследования была оценка влияния культивирования без нарушения условий культивирования с использованием TLS на клинические исходы.
Предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии в этой клинике требует вспомогательного хэтчинга на 3-й день, что требует извлечения чашки Петри из инкубатора, нарушая процесс культивирования. Кроме того, отбор эмбрионов в циклах ПГТ-А зависит от результатов генетического анализа. По этим причинам циклы ПГТ-А были исключены. Однако будущие исследования должны изучить влияние одноэтапного культивирования и непрерывного мониторинга в циклах ПГТ-А, особенно поскольку эмбрионы от пациентов старшего возраста могут быть более уязвимы к нарушениям окружающей среды. Перинатальные результаты также не оценивались, хотя недавняя публикация подтверждает безопасность этой стратегии культивирования для долгосрочного здоровья новорожденных.
При анализе клинических исходов наблюдались лучшие показатели наступления беременности, OPR и живорождения при первом переносе при CS2. Кумулятивные результаты за цикл были лучше в CS2 в циклах донации ооцитов, но схожи в двух группах в циклах аутологичных. Различия в результатах, полученных в циклах аутологичных и донации ооцитов, могут быть связаны с различным внутренним качеством эмбрионов в каждом типе цикла. В аутологичных циклах наблюдаемая положительная тенденция более очевидна при первом переносе. После этого меньшее количество и неоптимальное качество оставшихся эмбрионов в когорте, связанные с более поздним возрастом ооцитов, могут стать ограничивающим фактором, препятствующим эффекту стратегии культивирования. Кроме того, больший размер выборки донорских ооцитов (отражающий популяцию пациентов в испанских частных клиниках) увеличивает статистическую мощность.
Большинство рандомизированных контролируемых исследований, сравнивающих ненарушенное и последовательное культивирование, не смогли обнаружить значительных различий в клинических результатах. Однако эти исследования имеют ограничения, неоптимальные дизайны исследований или были выполнены с использованием устаревших процедур, таких как перенос эмбрионов на стадии дробления. Превосходство переноса эмбрионов на стадии бластоцисты было продемонстрировано и уже считается стандартом. Самое главное, что концепция непрерывного культивирования начинает приобретать смысл только при выполнении длительного культивирования. Аналогично, беспрерывное культивирование достигает своего максимального потенциала только при сочетании одношаговой среды и системы TLS. Независимо от того, могут ли оба нововведения быть связаны с лучшими результатами по отдельности, именно их сочетание действительно привлекательно, принося гибкость, экономию времени и оптимизацию лабораторным протоколам.
Непрерывное культивирование в системе TLS также открыло новое измерение в отборе эмбрионов. Инструменты, основанные на морфокинетике и анализе изображений, обеспечивают автоматизацию и стандартизацию и потенциально улучшают отбор эмбрионов по сравнению с морфологической оценкой. В данном исследовании отбор эмбрионов проводился на основе морфологии в системе CS1 и с помощью доступных полуавтоматических инструментов в каждой системе TLS в системе CS2, чтобы проверить все возможности новой системы культивирования.
В результате были зарегистрированы лучшие показатели наступления беременности, OPR и LBR в группе CS2 при первой эмбриональной переносимости, что свидетельствует об улучшенном отборе эмбрионов. Ограничением данного исследования является включение различных моделей TLS и питательных сред. Постоянным сбивающим фактором в большинстве исследований по этой теме является множество вариантов, доступных на рынке как инкубаторов, так и питательных сред, что затрудняет обобщение. Чтобы устранить это ограничение, были представлены LBR и кумулятивный LBR для каждого типа среды и каждой модели инкубатора, включенных в исследование. Однако данное исследование не было предназначено для оценки конкретной модели инкубатора или марки среды. Вместо этого целью был анализ совокупного эффекта стратегии «безмятежности» в реалистичном контексте.
ВЫВОДЫ
Система культивирования без помех, сочетающая инкубаторы с интегрированной технологией покадровой съемки и одноэтапной питательной средой, по-видимому, оказывает двойной положительный эффект на результат циклов ИКСИ. Мы наблюдали благоприятное влияние на развитие эмбриона, предполагая, что эта стратегия обеспечивает оптимизированные условия окружающей среды. Кроме того, отбор эмбрионов может быть улучшен благодаря инструментам, основанным на анализе изображений и морфокинетической оценке, предоставляемым системами TLS. В результате наблюдалось улучшение клинических результатов при использовании нетронутой культуры в циклах донорства ооцитов и аутологичных циклах. Кумулятивные результаты также были улучшены при использовании нетронутой культуры в циклах донорства ооцитов. Эти результаты предполагают, что система культивирования, сочетающая интегрированные инкубаторы для покадровой съемки и одноэтапную культуральную среду, может способствовать максимальному повышению шансов на успех у пациентов, проходящих лечение методом ИКСИ, за счет получения большего количества бластоцист и лучшего потенциала, при этом минимизируя количество необходимых этапов и облегчая лабораторный рабочий процесс.