.
Авторы открытия :
Доктор медицинских наук Тельпухов Владимир Иванович и биофизик Щербаков Павел Васильевич
Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет)
.
— Слева направо: профессор Тельпухов Владимир Иванович и биофизик Щербаков Павел Васильевич, первооткрыватели КЛАТРАТНОГО АНАБИОЗА, во время своей консультативной работы в Пущино по передаче пионерного опыта в области глубокой гипотермии и клатратной консервации местным учёным [Селфи на фоне Института биофизики клетки РАН (ИБК РАН) в Пущино]
.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
.
«По мнению биофизика Щербакова П.В., гипотеза панспермии о первичном осеменении Земли из космического пространства позволяет найти лучшее из всех объяснение именно в свете клатратного анабиоза. Концепция клатратного анабиоза тесно связана с гипотезой панспермии, так как клатраты различных газов могут существовать в полярных шапках Марса, кольцах Сатурна, кометах, астероидах и т. д. Согласно идее Щербакова, окраинные места Солнечной системы, где находятся Облако Оорта и Пояс Койпера, являются долговременными хранилищами “зародышей жизни”, так как они пересыщены веществами, необходимыми для проявления клатратного анабиоза. Здесь созданы все необходимые условия образования клатратов, так как периферия Солнечной системы содержит большие запасы метана, этана, угарного газа и других клатратообразующих веществ на фоне изобилия воды. Согласно представлению Щербакова именно кометы доставляют биологических "затворников", находящихся под клатратной защитой, из Облака Оорта и Пояса Койпера»
.
.
___________________________________________________
.
«ОФОРМЛЕНО В СООТВЕТСТВИИ С ТРЕБОВАНИЯМИ РАЕН»
.
1. 2. Описание открытия
1.2.1. Описание должно содержать следующие разделы:
— название открытия;
— вводная часть;
— сведения о приоритете;
— сущность открытия;
— доказательства достоверности;
— область научного и практического значения;
— формула открытия;
— библиография.
.
.
___________________________________________________
.
ОПИСАНИЕ ОТКРЫТИЯ
.
Название открытия:
.
«Закономерность обратимого изменения жизнедеятельности структурно-функциональных единиц живых организмов, насыщенных тяжёлыми инертными газами (Ar, Kr, Xe), в условиях отрицательных температур и повышенного давления».
.
Открытие относится к области биологии, к её разделу — криобиология.
.
Ранее было известно, что длительное сохранение организмов или их частей без потери жизнеспособности возможно только при так называемом «полном анабиозе» [12], когда за счёт выведения всей свободной (биологически активной) воды из биохимических взаимодействий в клетке обмен веществ в соответствующих биологических объектах прекращается [35, 37].
В противном случае присутствие даже незначительного количества такой воды в виде жидкости всё же способствует протеканию процессов диссимиляции [12] и, как следствие, наблюдается существенное ограничение пролонгации жизнеспособности [37].
Так в случае перехода в анабиоз путём глубокого замораживания (так называемая «криоконсервация биообъектов» [3]), для соблюдения вышеприведённого теоретического положения необходимо было учитывать известный биофизический факт, что свободная вода в клетке из-за капиллярного эффекта не замерзает полностью вплоть до -196°C [15, 61].
А потому в соответствии со сложившимися представлениями, полный анабиоз должен был начать проявлять себя лишь только с данного значения температуры [12, 35, 37].
.
Однако, указанные представления находились в противоречии с известными научными фактами длительного (до 400 тыс. лет) пребывания жизнеспособных микроскопических объектов в толще антарктического ледника при умеренно-отрицательных местных температурах (господствующие температуры от -55°C до -57°C) [1, 2].
Так в начале 1970-х годов Абызовым С.С. с группой соавторов в составе Кудряшова Б.Б., Бобина Н.Е., и Короткевича Е.С. было открыто явление сверхдлительного анабиоза у микроорганизмов, обнаруженных на различных эшелонах антарктического ледника. Зарегистрировано как открытие в 1995 году [18].
Таким образом, известное фундаментальное исследование Абызова С.С. с соавторами, относящееся к Антарктиде «Явление сверхдлительного анабиоза у микроорганизмов» [18] хотя и получило статус научного открытия, совершенно не раскрывает самого механизма сохранения жизнеспособности найденных здесь биологических объектов.
Научное положение, выдвигаемое в качестве данного научного открытия, является всего лишь обычной констатацией самого факта наличия на шестом континенте уникального по своей длительности анабиоза именно как такового.
Другие независимые авторы также подтвердили, что найденные в ледниковом панцире Антарктиды биообъекты действительно пребывают в некоем парадоксальном состоянии, не вписывающемся в классические рамки [12].
Таким образом, можно отметить явные противоречия в теоретических положениях, выразившиеся в том, что указанные научные факты никак не могут быть объяснены с позиций известных представлений об анабиозе вообще.
.
Кроме того, можно отметить наличие и других научных фактов, которые так же не могут быть объяснены с позиций известных представлений об анабиозе.
Не поддаются объяснению аналогичные биологические находки с возрастом в миллионы лет в тундровых зонах Земли [10, 4, 5]. Жизнеспособные микроорганизмы были найдены в погребённых почвах зон вечной мерзлоты, где значения умеренно-отрицательных температур ещё выше, чем в антарктическом случае (от -2°C до -8°C) [4].
Таким образом, сложившиеся представления и теоретические положения и в этом случае находятся в противоречии с научными фактами, которые так же не могут быть объяснены с позиций устоявшихся представлений об анабиозе.
.
Первая публикация сущности открытия была осуществлена вследующих источниках:
.
А. С приоритетом от 7 января 1985 года, установленным по дате целенаправленного перевода Щербакова П.В. на работу в академическую группу академика АМН СССР Кованова В.В. (выписка из трудовой книжки о зачислении) в связи с ознакомлением научным коллективом изложенной сущности открытия и одобренной ими.
Таким образом, Щербаков П.В. перешёл в научное подразделение академика АМН СССР Кованова В.В. (территориально базирующееся на кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии 1 Московского медицинского института им. И.М. Сеченова) по обоюдовыгодной договорённости, заинтересовав научный коллектив предложенной пионерной идеей.
Выдвинутое предположение, что при отрицательных температурах иммобилизация свободной (биологически активной) воды в клетке путём образования клатратных соединений может поспособствовать приведению биологического объекта к анабиозу, неизвестному ранее науке, — было поддержано сотрудниками и включено в общий долгосрочный план работ академической группы академика АМН СССР Кованова В.В., а Щербаков П.В. для осуществления этого плана работ был зачислен в команду на штатную должность.
Неизвестный ранее науке вид анабиоза предварительно получил собственное имя «Клатратный анабиоз».
Командой Кованова В.В. в качестве экспериментальной модели было выбрано сердце лабораторной крысы in situ («на своём месте»), а потому преддверием клатратного анабиоза данного органа должна была стать обратимая глубокая гипотермия всего организма млекопитающего.
Из-за чего перед исследовательским коллективом возникла острая необходимость разработать совершенно новую, неизвестную ранее методику обратимого охлаждения мелкого лабораторного животного вплоть до 0°С.
В результате проведённых работ впервые в мировой экспериментальной практике был предложен метод принудительной конвекции для обратимого захолаживания всего животного от нормотермии до 0°С.
Одновременное охлаждение/согревание сразу всей поверхности высшего млекопитающего (погруженного ниже поверхности теплоносителя), в том числе и головы животного, проточной ледяной/тёплой водой стало инновационным прорывом в области гипотермии, что отображено в следующих источниках:
.
.
.
— Эти три приоритетные источника информации (А, Б, В) соответствуют Первой части открытия: «Разработка общего обратимого охлаждения организма млекопитающего от нормотермии до 0°С с целью перевода всего объекта в жизнеспособном состоянии непосредственно к рубежу отрицательных температур («преддверие анабиоза»).
.
Более подробно сущность открытия, его научное и практическое значение изложены в работах:
.
Г. 13 января 1991 года на кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии 1 Московского медицинского института им. И.М. Сеченова на расширенном семинаре академической группы академика АМН СССР Кованова В.В. по результатам проведённых исследований была подтверждена сущность открытия и принято решение оформить и подать заявку на открытие.
Но в связи с развалом СССР, 14 мая 1991 года официально отменена государственная регистрация научных открытий и упразднён соответствующий институт. Находка не была внесена в реестр научных открытий.
В связи с политической нестабильностью в стране на тот период и как следствие, усугубления экономического кризиса, научная деятельность в академической группе оказалась парализованной, началась текучка кадров.
22 февраля 1994 года умер руководитель академической группы академик АМН СССР Кованов В.В., а его персональное научное подразделение распалось.
.
Д. 15 июня 2004 года для сохранения приоритета в этой области по результатам прошлых исследований бывшими сотрудниками академической группы академика АМН СССР Кованова В.В. было подано заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение: «Способ криоконсервации органов и тканей in situ». 27 января 2006 патент опубликован.
.
Ж. Щербаков П. В., Тельпухов В. И. Бессмертие под газом // Химия и жизнь. – 2006. – № 8. – С. 34-39.
.
.
— Эти четыре источника информации (Г, Д, Ж, З) соответствуют Второй части открытия: «Сохранение в жизнеспособном состоянии клеток, тканей, органов, систем целостного организма, насыщенного составляющими атмосферного воздуха тяжёлыми инертными газами (Ar, Kr, Xe), при воздействии на биообъект отрицательных температур в сочетании с гипербарией этими газами».
.
Достоверность открытия и его приоритет подтверждаются в работах других авторов:
.
I. Подтверждение Первой части открытия, связанной с разработкой общего обратимого охлаждения организма млекопитающего от нормотермии до 0°C с целью перевода всего биообъекта в жизнеспособном состоянии непосредственно к рубежу отрицательных температур («преддверие анабиоза»):
.
.
2) Утешев В. К., Швирст Н. Э., Манохин А. А., Волынкин Л. И., Аверин А. С., Щербаков П. В., Тельпухов В. И., Фесенко Е. Е. Устройство и способ для экспериментального изучения и расширения временных границ сверхглубокой гипотермии // Патент на изобретение / RU (11) 2 688 722 (13) C1 (51) МПК A61H31/00 (2006.01)
.
3) Видео: «Обратимая глубокая гипотермия крысы»
.
II. Подтверждение Второй части открытия, связанной с сохранением в жизнеспособном состоянии клеток, тканей, органов, насыщенных инертными газами, при воздействии на биообъекты отрицательных температур в сочетании с гипербарией этими газами:
.
1) Грязнов А.Ю., Мотовилова Н.О., Миличенко И.В., Антропова О.Е., Рухляда Н.Н., Петкявичюс И.Ч., Гасымова Д.М., Мельникова М.А. Способ криоконсервации яичниковой ткани // Патент на изобретение / (19) RU (11) 2012 103 061 (13) А (51) МПК C12N 5/07 (2010.01).
.
2) Макаров А. Ф., Тоньшин А. А., Бонитенко Е. Ю. Способ сохранения органов и тканей в составе целостного организма в жидкости при температурах ниже 0°C под давлением в среде инертного газа // Патент на изобретение / (19) RU (11) 2 748 496 (13) C1 (51) МПК A01N 1/00 (2006.01)
.
3) Макеев О.Г., Понамарев А.И., Коротков А.В. Способ криоконсервации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток // Патент на изобретение / (19) RU (11) 2 433 173 (13) C1 (51) МПК C12N 5/00 (2006.01).
.
4) Макеев О.Г., Пономарев А.И., Коротков А.В. Применение клатратобразующего газа для разработки способа сберегающей криоконсервации стволовых клеток // Материалы I Международной научнопрактической конференции 31 марта 2011 // Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий г. Екатеринбург. – 2011. – стр. 180-183
.
5) Полежаева Т.В., Лаптев Д.С., Соломина О.Н., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Утемов С.В., Шерстнев Ф.С., Костяев А.А. Способ криоконсервирования лейкоцитов с ксеноном // Патент на изобретение / (19) RU (11) 2013 108 516 (13) А (51) МПК A01N 1/02 (2006.01)
.
6) Пономарев А. И., Макеев О. Г., Зверева А. И., Коротков А. В. Исследование консервирующих свойств клатратов инертного газа ксенона на модели краткосрочного хранения кожных лоскутков // Материалы III Межрегиональной научно-практической конференции «Клеточные технологии — практическому здравоохранению». Екатеринбург. 2014 г. Стр. 78 – 83.
.
7) Сведенцов Е.П., Лаптев Д.С., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Шерстнёв Ф.С., Князев М.Г. Оценка криопротекторных свойств аргона // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований — 2012. — №4. — С. 55-55.
.
8) Худяков А.Н., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н. Устройство для криоконсервирования клеточных взвесей в атмосфере газовых протекторов // БИОФИЗИКА ЖИВОЙ КЛЕТКИ — 2014. — том 10. — С. 209-211.
.
.
10) ILYIN I.Y., TKACHMAN M.G., URUSOVA M.E., JONES J.S., GRIESHOBER W.E. Method of preserving a platelet concentrate under elevated xenon concentration and pressure with refrigeration. United States Patent US-8158339-B2
.
11) Sheleg S.V., Hixon H.L., Cohen B., Svarovsky S.A. Hypothermic preservation of biological tissues and cells. United States Patent US 8,124,329 B2
.
.
Сущность открытия состоит в том, что нами обнаружено неизвестное ранее проявление жизнеспособности при воздействии на биологические объекты, насыщенные тяжёлыми инертными газами (Ar, Kr, Xe) [11, 39, 7], повышенного давления и отрицательной температуры [47]. Этому неизвестному ранее науке феномену мы дали собственное имя — «клатратный анабиоз» [34, 49].
Общеизвестна основная физико-химическая сущность вообще анабиоза как такового — это максимальное снижение содержания свободной (биологически активной) воды в клетках [12, 37].
Ранее было известно о существовании в природе лишь трёх видов анабиоза: «анабиоз в результате высыхания», «анабиоз в результате глубокого охлаждения», «анабиоз в результате нахождения в среде с высокой концентрацией солей и высоким осмотическим давлением» [12]. Таким образом, переход к какому-либо из всех этих известных видов анабиоза всегда (!) происходит или при отнятии воды из клеток (высушивание и осмос), или же при её иммобилизации (замораживание) [37].
На наш взгляд, наиболее перспективным для медико-биологической практики из этих трёх видов анабиоза на сегодняшний день является так называемый «криоанабиоз» [12], достигаемый в результате глубокого охлаждения, при котором возможно максимальное связывание свободной воды и относительно полное угнетение метаболических процессов.
В связи с этим рассмотрим понятие «активная жизнедеятельность» [13] применительно к нашему исследованию. Было известно, что нижняя граница активной жизнедеятельности лимитирована, прежде всего, капельножидкой водой, поэтому кристаллизация воды в омывающих жидкостях и клетках служит критическим порогом жизни [37].
Но при этом наступающая внутриклеточная кристаллизация является и непосредственной причиной криоповреждения [15]. Из-за чего искусственный перевод биологических объектов в криоанабиоз [12], сохранение в нём и возвращение к активной жизнедеятельности в криобиологии осуществляется только при помощи двух основных методов. Вот они.
.
1.Сверхбыстрое охлаждение биологических объектов, с превращением внутриклеточной воды в стеклообразный тип льда (так называемая «витрификация») и последующее очень быстрое согревание этих объектов, с переходом воды из твёрдого аморфного состояния непосредственно в жидкое, без девитрификации (без так называемой «рекристаллизации»). — Метод применим только в тех случаях, когда объём образцов чрезвычайно мал [3, 25].
.
2.Использование криозащитных сред, включающих водные растворы криопротекторов (глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, пропиленгликоль и др.), обеспечивающий в частности мелкоструктурную кристаллизацию воды (неопасную для клеток) в виде обычного типа льда с последующим переходом в аморфное состояние. Метод уже отработан для замораживания суспензий клеток, но не решает вопросы, связанные с замораживанием органов [3, 15, 42, 43, 44].
.
Применение само по себе криопротекторов в неполной мере препятствует повреждению клеточных структур в процессе замораживания-оттаивания органа — во-первых, из-за неравномерного распределения этих криозащитных веществ по объёму любого крупного биологического объекта, во-вторых, из-за появления в последнем высоких температурных градиентов и ими обусловленных градиентов давления [15, 42].
При этом наступающая кристаллизация воды в органе распространяется от поверхности к центру неравномерно (имеет место быть так называемый «фронт кристаллизации» [3]), что ведёт к чисто механическому повреждению предварительно замороженных слоёв и их растрескиванию [43].
Критическую ситуацию в данной области хорошо иллюстрируют следующие исторические высказывания авторитетных специалистов криомедицины, которые не потеряли своей актуальности и в настоящее время: «теоретические представления о причинах и механизмах криоповреждения и криозащиты представляют собой совокупность разрозненных концепций с ограниченной областью применения» Кирпатовский В.И. [15], а «криоконсервация органов является проблемой, неразрешённой ни в теоретическом, ни в практическом отношении» Белоус А.М. [3].
Способность биологического объекта сохранить целостность морфофункциональных структур и жизнеспособность после глубокого подавления метаболизма холодом [37] может быть подтверждена полноценным восстановлением, например, органа после отогрева и включения его в кровоток [15].
Так пересадка органов у мелких лабораторных животных (гетеротопическая пересадка сердца у крыс по Abbott [52]) позволяет признать её наиболее адекватным методом оценки жизнеспособности трансплантата [43]. Что и было успешно продемонстрировано в эксперименте авторами открытия [47].
Таким образом, до данного открытия в науке не был известен переход биологических объектов при отрицательных температурах к анабиозу, основанный на выведении значительной части биологически активной воды в клетках из биохимических взаимодействий путём иммобилизации её в виде гидратов, которые в свою очередь начинают инициировать масштабную кристаллизацию остающейся незадействованной свободной воды (авторское название «гибридная кристаллизация» [34]).
.
Для подтверждения достоверности открытия были проведены следующие эксперименты.
.
В 1980-е годы в персональном научном подразделении академика АМН СССР Кованова В.В. с утверждённым официальным названием «Академическая группа», изучающим, в том числе и проблемы анабиоза [16], была сформулирована концепция «клатратного стазиса» [49].
Было сделано предположение, что если проводить охлаждение биологического объекта, насыщенного естественными составляющими атмосферного воздуха тяжёлыми инертными газами аргоном, криптоном, ксеноном [11, 39, 7], до отрицательных температур при повышенном давлении [34], то образующиеся микрокристаллогидраты этих тяжёлых инертных газов, будучи по своей сути инициаторами кристаллизации [8] (так называемые «кристаллические зародыши» [3]), спровоцируют активную масштабную кристаллизацию оставшейся, незадействованной гидратообразованием свободной воды.
.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
.
Рассмотрим, что стало предпосылкой теоретических обоснований и экспериментальных разработок академической группы Кованова В.В..
Впервые наркотические свойства ксенона были предсказаны в 1941 году Лазаревым Н.В. [19]. Изучая наркотическое действие физиологически индифферентных газов гелия, аргона, криптона и ксенона, Лазарев показал, что в силу малой растворимости в воде достичь наркоза с их помощью можно в барокамере под повышенным давлением (лишь только ксеноновый наркоз начинает проявлять себя уже при нормальном атмосферном давлении [7]).
К сожалению, своё научное предвидение российский теоретик смог экспериментально подтвердить лишь в 1946 году (помешала Вторая мировая война). Он первый из учёных, кто отметил также и консервирующее действие инертных газов под повышенным давлением: ещё в том же 1941 году Лазаревым Н.В. было показано, что при небольших давлениях в среде инертных газов задерживается скисание молока и гниение мяса.
Что инертные газы (в том числе и ксенон) способны образовывать кристаллогидраты в биологических объектах продемонстрировал в 1939 Никитин Б.А. [27]. Быстропроходящая диссоциация кристаллогидратов в живых тканях при изменениях давления газа и температуры среды, как подметил Никитин Б.А. в своих уникальных опытах, свидетельствует о том, что индифферентные газы не вступают в прочные соединения с содержимым клеток и не образуют трудноразрывных связей. Такое понимание процесса открывало широчайшие возможности для непосредственного управления консервирующими свойствами данных веществ.
Полинг Л.К. взял за основу эти пионерные исследования и разработал в 1961 году свою Новую молекулярную теорию наркоза [58]. Лазаревым Н.В. и Никитин Б.А. было установлено, что инертные газы в водных средах организма могут образовывать микрокристаллы клатратного типа, а это и дало основание Полингу Л.К. создать теоретическое положение относительно механизма наркоза.
Согласно его оригинальной теории, анестетики образуют в тканях организма микрокристаллогидраты, повышающие импеданс, тормозящие биоэлектрическую активность и, что особо важно для нашего случая, клеточный метаболизм (Полинг Л.К. вслед за Никитиным Б.А. и сам начал проводить подобные эксперименты).
Своей Новой молекулярной теорией наркоза Полинг Л.К. теоретически обосновал и эффект консервирующего действия микрокристаллогидратов, в том числе, инертных газов, предположив, что раз вода в норме служит средой для протекания биохимических процессов в клетке, то её иммобилизация в виде строительства микроостровков из клатратных образований должна была бы несколько снижать клеточный метаболизм [58]. Что стимулировало всплеск научной активности в этой области.
Начиная с 1960-х годов, многие экспериментаторы стали демонстрировать успешную консервацию биологических объектов, помещаемых в условия слабоположительных температур и повышенного давления (Lyons G.W., Dietzman R.H., and Lillehel R.C. [56]; Rassat J.P. and Haxne I.I. [60]; Groenewald I.V., VanZybI I.W., Weber H.W., Murphy G.P. [55] and others).
Все они отмечали хорошие результаты после 24-часовой гипотермической консервации почки в условиях гипербарии инертными газами — Lyons G.W. в 1966 году, Rassat J.P. и Haxne I.I. в 1967 году, Groenewald I.V. в 1969 году.
Успешную, уже 8-дневную консервацию крысиных почек в условиях глубокой гипотермии 2°С и гипербарии ксеноном в 3 атм провёл в 1970 году Ruile K., а вслед за ним Шумаков В.И. удачно консервировал почки собак также в течение 8-дней — в условиях гипотермии (2–4)°С и гипербарии аргоном в (1,5–2,0) атм [44].
Участники тех исторических исследований подтвердили у вышеперечисленных газовых клатратобразующих веществ явные криопротекторные признаки, наиболее ярко-выраженные у ксенона. Биологические объекты под защитой этих «газовых криопротекторов» (наше определение) достаточно продолжительные сроки оставались неповреждёнными. В случае с почкой, взятой ими за основу в качестве экспериментальной модели — вплоть до восьми дней, что было совершенно необычно для данного диапазона температур [44].
Необходимо напомнить, что самый первый криопротектор, а им оказался хорошо известный глицерин, был открыт в 1912 году российским ботаником-физиологом Максимовым Н.А., причём также при слабоположительных температурах [24].
Таким образом, ещё тогда в 1960-е годы уже становилось понятным, что «протекторы нового типа» (наше определение), прежде всего ксенон, когда-то в будущем смогут работать подобно обычным их аналогам (глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, пропиленгликоль и др. [15]) — и тоже при температурах от 0°С и ниже, вплоть до –196°С [3].
Оптимизм в этом вопросе был вполне обоснован, так как базировался на демонстрации успешных опытов Максимова Н.А. [24] с глицерином: впоследствии как выяснилось, глицерин оказался универсальным криопротектором, эффективным для диапазона слабоположительных температур и для значений уже существенно ниже 0°С [25].
Именно в свете этих научных наработок американский писатель-футуролог Роберт Прегода в своей научно-популярной книге публицистической направленности «Анабиоз. Продление молодости: обещание геронтологи», написанной в 1969 году, (но как можно заметить всё-таки позднее, чем вышеприведённые прорывные источники [60, 56, 55]) «сделал предположение», что криопротектором будущего станет ксенон [59].
Итак. Предполагалось, что данный эффект парадоксальной консервации, наблюдаемый при положительных околонулевых температурах, происходит благодаря незначительному снижению метаболизма за счёт иммобилизации некоторого количества клеточной воды — путём образования отдельно-разбросанных по всему объёму клетки льдоподобных микроструктур инертных газов.
К этому времени пришло и понимание, что снижение содержания свободной (биологически активной) воды в клетке является физико-химической основой перехода ко всем известным на сегодня трём видам анабиоза, в частности — к криоанабиозу сути криоконсервации [3, 12].
Что во время процесса гидратообразования в слабоположительном диапазоне температур часть биологически активной клеточной воды выводится из биохимических взаимодействий способом так называемого «замораживания» (подобно обычному льдообразованию при минусовых значениях температур), в дальнейшем нашло своё экспериментальное подтверждение в опытах Волкова В.Я. и Родина В.В. [9].
Несмотря на неоспоримые заслуги этих учёных в непосредственном изучении клатратообразования в биологических материалах, хорошо известно, что они вообще не затрагивали в своих биологических опытах диапазон отрицательных температур, ограничиваясь только слабоположительными их значениями [9, 29].
О том, что они никогда не работали с отрицательными температурами применительно к клатратообразованию в биологических объектах, например, Родин В.В. всегда открыто признавал и неоднократно дословно писал: «Использованы для разработки альтернативного низкотемпературным воздействиям способа "замораживания" биосистем выше 0°С» [30].
Таким образом, никто из зарубежных и отечественных исследователей так и не перешёл к низкотемпературным экспериментированиям с биологическими объектами, предварительно насыщенными инертными газами, по всей видимости, опасаясь так называемого «низкотемпературного повреждения» [15].
Именно в научной группе академика АМН СССР Кованова В.В. впервые продемонстрировали, что данный вид анабиоза существует в природе и проявляет себя при отрицательных температурах [47], а данные вещества, благодаря которым можно добиться анабиотического состояния назвали «газовые криопротекторы» [34].
.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
.
Теоретически такая «гибридная кристаллизация» (наше название) [34] должна была позволить, ещё при умеренно-отрицательных температурах всю активную клеточную воду вывести из биохимических взаимодействий [9]. Кристаллизация же, развивающаяся без продвижения от периферии к центру «фронта кристаллизации» [15], а сразу по всему объёму замораживаемого объекта, не вызывает повреждений клеточных структур [42].
Первоначально в экспериментальном подтверждении нуждалась сама сформулированная концепция. В связи, с чем были проведены уникальные опыты, целью которых являлось определение принципиальной возможности криоконсервации биологических объектов, насыщенных гидратобразующими веществами аргоном, криптоном, ксеноном, относящимися к компонентам атмосферного воздуха.
Для проведения пробного тестирования самой идеи клатратной криоконсервации и была разработана малая барокамера-капсула, представляющая из себя миниатюрный сосуд высокого давления с габаритными размерами, выбранными специально под горловину стандартного 24-литрового сосуда Дьюара [34].
.
— Экспериментальная малая барокамера-капсула
.
Исследовательская крио-капсула позволяла вести экспериментирования с животными клетками, тканями, органами и использовать для этого как отдельные тяжёлые инертные газы, так и их смеси. Микроагрегат мог помещаться в различные хладагенты: обычный лёд, холодный воздух морозильной камеры холодильника, «сухой лёд», пары жидкого азота, сам жидкий азот и др.
Исследовательская микро-барокамера была рассчитана своими прочностными характеристиками на максимальное рабочее давление в 155 атм, что позволяло, наряду с выбором определённой рабочей температуры, варьировать так же и этим параметром (в сторону уменьшения от указанной величины).
Согревать барокамеру-капсулу можно было или медленно (естественным путём при комнатной температуре) или быстро (горячим воздухом и водой). В крио-барокамере успешно замораживали клетки (сперматозоиды), ткань (кровь), небольшие органы (сердце крысы). Статистический материал не набирали. О сохранении жизнеспособности после криоконсервации судили лишь поверхностно: сперматозоидов — по их подвижности; крови — по её гемолизу; сердца — по наличию сократительной функции [52]. В дальнейшем эти пробные опыты легли в основу при разработке нами крио-барокамеры для целостного организма мелкого лабораторного животного (крысы).
В процессе проектирования большой крио-барокамеры возникли сложности чисто технического характера, но которые поменяли весь первоначальный сценарий дальнейших исследований. Из всех компонент воздуха пришлось остановиться на рабочей смеси только из трёх тяжёлых инертных газов [38]. Дело в том, что для образования, например, клатратов азота и кислорода, которые так же можно использовать для клатратной криоконсервации, необходимо создавать значительно более высокое давление, чем для других составляющих атмосферного воздуха (наибольшее для азота) [22]. И, как следствие, обязательное в таком случае применение сложной декомпрессии млекопитающего [44].
Всё это усложняло исследовательский инструментарий и в некоторой степени ограничивало проведение опытов на целостном организме (перед собой мы ставили задачу подобрать такое идеальное рабочее давление, что бы появилась возможность вообще избежать каких-либо декомпрессионных мероприятий).
В этой связи было известно, что при нормальном атмосферном давлении (760 мм рт. ст.) температура диссоциации других постоянных составных частей воздуха, таких как тяжёлые инертные газы ксенон, криптон, аргон, меняется в приемлемых пределах: -3,4°C для ксенона, -27,8°C для криптона, -42,8°C для аргона [17]. Но, к сожалению, здесь присутствует температурный пробел (от 0°C до -3,4°C), не охваченный стабильным гидратобразованием при нормальном давлении.
Чтобы исключить этот промежуток, достаточно было выбрать 1,5 атм, соответствующие давлению диссоциации гидратов ксенона при 0°C [17]. К тому же, при применении в намеченном эксперименте такого незначительного давления, имело существенное значение и то, что в соответствии с теоретическими положениями якобы должна была отпасть всякая необходимость в дальнейшей декомпрессии животного [6, 26, 32] (к сожалению, предположение это, как показали наши опыты, оказалось ошибочным, о чём будет изложено ниже).
Отсюда следовало, что если в планируемой серии экспериментов на целостном организме применить смесь сразу из всех трёх перечисленных инертных газов и общее давление в 1,5 атм, то для целей криоконсервации станет возможным использовать абсолютно весь диапазон температур от 0°C до -196°C.
Но было известно и то, что при температурах, близких к температуре жидкого азота происходит вымораживание тяжёлых инертных газов (ксенона при -111,85°C, криптона при -156,55°C, аргона при -189,35°C) [39]. Следовательно, сама возможность применения в качестве хладагента жидкого азота, позволяла, в перспективе, использовать в качестве рабочих и криогенные температуры. Например, при хранении биоматериала в космическом пространстве (что способствовало бы ещё и продвижению очень важной для философского осмысления гипотезы о появлении самой жизни на Земле — так называемая «панспермия» [49]).
По нашему мнению, экспериментальные данные, пусть и полученные только с помощью отдельных компонент атмосферного воздуха (Ar, Kr, Xe), вполне подтверждают достоверность открытия. — Газовые гидраты в основном имеют одинаковые кристаллические решётки [17, 21] и, следовательно, физико-химические процессы, связанные с ними, в биологических объектах развиваются, по всей видимости, одинаково.
Поэтому в соответствии с приведёнными теоретическими положениями и собственными наработками на малой барокамере, уже для большого сосуда нами окончательно была выбрана газовая смесь ксенона, криптона, аргона. А в качестве рабочего давления взяты те «универсальные» 1,5 атм.
.
.
Использование нами температуры жидкого азота объясняется ещё и тем, что в соответствии со сложившимися представлениями — это именно та температура при которой гарантированно гибнет всё живое, если не применять известные на сегодня методы криозащиты [42].
Для доказательства этих теоретических предположений нами был выполнен уникальный эксперимент по замораживанию целостного организма высшего млекопитающего (крысы) в условиях повышенного давления тяжёлых инертных газов, с попыткой последующего оживления всего животного или же, в крайнем случае, его отдельных изолированных органов. Таким образом, целью данного исследования стало выявление как таковой возможности обратимой криоконсервации крупных биологических объектов, с перспективой длительного их сохранения в состоянии анабиоза.
Суть эксперимента сводилась к следующему. Специально сконструированная для охвата всех последовательностей-этапов большого комплексного эксперимента уникальная барокамера могла работать и при положительных температурах и при отрицательных. При этом, будучи нагруженная давлением до 1,5 атм.
.
— Экспериментальная анабиотическая установка (крио-барокамера для крысы под «Способ криоконсервации органов и тканей in situ»)
.
Испытания на данном агрегате, ещё при нормальном атмосферном давлении, показали реальную возможность достижения максимальной глубины гипотермии 0°C простым поверхностным охлаждением целостного организма крыс обычной проточной ледяной водой, причём, со 100% выживаемостью животных [45, 46, 54, 36, 51, 50].
.
— Схема экспериментальной гипотермической установки для обратимого охлаждения крысы до 0°C
.
.
Поэтому, данная методика обратимого охлаждения, с одновременным проведением искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) в процессе развития глубокой гипотермии и стала базовой моделью для всего проекта [45, 46].
В последующих экспериментах, ещё до самого момента начала замораживания, также при нормальном атмосферном давлении, дополнительно, на фоне ИВЛ, животному производили принудительную ингаляцию выбранной рабочей смесью из трёх тяжёлых инертных газов (Ar, Kr, Xe) [47].
После насыщения организма данными газами, крысу при 0°C помещали сначала в условия повышенного давления этих же газов, а лишь затем отрицательных температур и охлаждали вплоть до -196°C. Эти внешние воздействия необходимы, на наш взгляд, для проявления клатратного анабиоза [49].
.
— Способ криоконсервации органов и тканей in situ состоит из четырёх этапов: I Гипотермия; II Захолаживание в парах жидкого азота; III Замораживание в жидком азоте; IV Согревание
.
После оттаивания и согревания крысы выполняли реанимационные мероприятия доступными методами, которые, к сожалению, не приводили к успеху в плане оживления всего организма — скорее всего из-за отсутствия, главным образом, технических возможностей для проведения всех необходимых протоколов декомпрессии [6, 26, 32].
При отогреве животного с несоблюдением необходимого протокола декомпрессии, полости тела заполнялись газом, а в кровеносном русле наблюдалось сильное пенообразование [53, 57] (как выяснилось позже, пенообразование вообще не происходит при использовании ксенона в 0,6 атм [41]).
Однако оценить эксперимент, всё же как положительный, позволил сам факт восстановления сократительной активности изолированного сердца крысы, перенёсшей глубокое, до криогенных температур охлаждение [47]. Сердце замороженного таким образом животного, промытое и пересаженное (после согревания всего организма) с помощью канюль на сосуды брюшной области другой крысе буквально тут же через короткий промежуток времени начинало нормально сокращаться [34].
.
— Рабочая схема анабиотической установки под «Способ криоконсервации органов и тканей in sit»
.
Итак. Предлагаемую авторскую методику испытали в опытах по криоконсервации сердца крысы-донора с последующей пересадкой его крысе-реципиенту [47]. По окончании согревания до 0°C у крысы-донора производили забор сердца. Выделенный трансплантат отмывали физиологическим раствором через аорту и выполняли пересадку сердца по методике «Abbott» на брюшные сосуды крысы-реципиента [52].
.
— Гетеротопическая пересадка сердца крысы по методике «Abbott»
.
От начала полной остановки сердца, вызванной холодовой кардиоплегией [45, 46], и до восстановления сократительной активности у пересаженного органа, временной интервал был в пределах шести-девяти часов [47]. За пересаженным сердцем наблюдали три часа, после чего реципиента выводили из эксперимента. Всего было поставлено 10 успешных опытов, что вполне укладывается в требования по набору статистического материала [13].
Донор — белая крыса линии «Wistar», самец, массой 300 г. Наркоз общий эфирный. Реципиент — белая крыса линии «Wistar», самец, массой 300 г. Наркоз комбинированный, гексенал-эфирный. Данные обрабатывали методом вариационной статистики [28]. Эти результаты вполне укладывались в нашу концепцию «клатратного стазиса» [34].
Вывод. В результате проведённых экспериментов было показано, что те представления и теоретические положения, которые были известны ранее в криобиологии, должны существенно измениться и дополниться.
Эксперименты были проведены в соответствии с «Общими этическими принципами экспериментов на животных», согласованными с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985 г.).
.
Полученные экспериментальные данные могут быть интерпретированы следующим образом. По всей видимости, удалось столкнуться с проявлением совершенно нового, неизвестного ранее науке вида анабиоза: переход к данному анабиозу происходит при иммобилизации свободной (биологически активной) воды в клетках путём образования клатратов [9]. Они же являются вожатыми [8] для дальнейшей кристаллизации такой воды при умеренно-отрицательных температурах (наше название «гибридная кристаллизация» [34]).
Приведём теоретическое обоснование установленного открытия. И в самом биологическом объекте наблюдается абсолютно та же картина, что вообще характерна для появления клатратов [8, 41, 62]. Считается, что один из непосредственных участников образования этих комплексных соединений, обязательно должен быть представлен в виде твердеющей матрицы (в данном, биологическом случае, состоящей из связанных воедино молекул активной воды) [33]. Но при этом вода кристаллизуется совершенно по-иному, нежели в свободном состоянии. То есть ни как обычный гексагональный лёд [22], а в виде рыхлых ажурных структур с многочисленными большими и малыми пустотами [8, 11, 21, 41].
В свою очередь, эти разнокалиберные полости заполняются другим, но уже групповым соучастником общего процесса строительства — какими-либо молекулами «посторонних веществ» [11, 33, 17]. Например, составными частями атмосферного воздуха [22]. То есть способными к гидратобразованию молекулами азота, кислорода, аргона, криптона, ксенона, углекислого газа, угарного газа, сернистого газа, метана, сероводорода, окислов азота и др. [11].
Итак. Связывание некоторой части клеточной воды начинается ещё при положительных, но уже близких к 0°C температурах, и происходит в результате образования по всему объёму клетки нестабильных микрокристаллогидратов некоторых газов воздуха [9, 58, 41]. Другая часть свободной воды всё ещё остаётся жидкой, даже после некоторого задействования её на строительство всех этих микрофрагментов твёрдой фазы [9].
Если же охлаждение под повышенным давлением перенести в область отрицательных температур, то микрокристаллогидраты («зародыши льдообразования» [3]) становятся инициаторами активной кристаллизации оставшейся в клетках свободной воды [8]. А так как большая её часть оставалась всё ещё незадействованной даже по завершении процесса полного клатратобразования, то в дальнейшем она превращается в обычный гексагональный лёд [22]. Но при этом, кристаллизация воды идёт сразу по всему объёму охлаждаемого объекта, что, как известно, не вызывает повреждений клеточных структур [15, 42, 43].
Газовые гидраты — это абсолютно самостоятельный класс соединений (так называемые «соединения включения» [17]). И, потому, ни каким льдом вообще не являются, так как не относятся ни к одному из 11 типов льда (имеются лишь внешние сходства) [22]. Следовательно, данный анабиоз ни как не может быть причислен к уже известному «анабиозу в результате глубокого охлаждения» [12].
К тому же, в соответствии с устоявшимися представлениями, при последнем (при так называемом «криоанабиозе» [12]) тотальная иммобилизация всей воды в клетке без участия клатратов происходит лишь при -196°C и только путём образования обычного льда [11, 22, 33, 61].
.
Данное открытие позволяет сделать вполне обоснованное предположение что, по всей видимости, клатратный анабиоз широко распространён в природе. Так, по нашему мнению, бактериям, попавшим в антарктический лёд сотни тысяч лет назад [1, 2] и в почвы зон вечной мерзлоты [10, 4, 5] миллионы лет назад (до 7,5 млн. лет !), помогли остаться в живых именно газы атмосферы Земли, образовавшие в клетках клатраты [49, 9, 17, 58, 41].
Открытие позволяет объяснить, как микроорганизмы смогли сохраниться в леднике Антарктиды и в вечной мерзлоте на протяжении сотен тысяч и миллионов лет, соответственно, при умеренно-отрицательных температурах [1, 2, 10, 4, 5].
Распределение бактерий по горизонтам ледника, описанное Абызовым С.С. и его коллегами из Института микробиологии РАН в начале 1980-х годов, на что был получен диплом на открытие [18], соответствует другому описанному в научной литературе распределению — распределению по эшелонам антарктического ледника гидратов постоянных газовых компонентов атмосферного воздуха [14, 22]. Так, Миллер С.Л. из Калифорнийского университета, впервые обнаруживший во льду Антарктиды залежи гидратов газов, предложил для них термин «клатратный лёд» [22].
Составляющие воздуха (азот, кислород, аргон, криптон, ксенон и др.) образуют микрокристаллогидраты не только в ледниках планеты, но и в бактериях расположенных в них. Они служат зародышами, инициирующими кристаллизацию клеточной воды, в обычных условиях не замерзающей при таких недостаточно низких температурах [49].
.
Кроме того, для целей криоконсервации возможно использование не только тяжёлых инертных газов (Ar, Kr, Xe) [11, 39, 7], но и других компонентов атмосферного воздуха, а в перспективе и вообще других гидратобразующих веществ [21]. Даже таких, как «элегаз» (гексафторид серы) [41]. Вполне логично применение и обычных жидких криопротекторов в сочетании с криопротекторами нового типа (наше название «газовые/клатратные криопротекторы» [34]) [19, 27, 23, 31, 20, 40]. Всё это переводит возможности криобиологии и криомедицины на совершенно новый уровень [41].
.
На основе открытия разработано следующее изобретение, защищённое патентом: «Способ криоконсервации органов и тканей in situ», заявленный 15 июня 2004 года, регистрационный номер 2004117804 [47]. Патентообладатель Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова.
Изобретение удостоено золотой медали на VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций, может быть применено в медицине, биотехнологии, ветеринарии, животноводстве, хранении продуктов питания, научных исследованиях, сфере ритуальных услуг [48].
.
Формула открытия:
.
«Экспериментально установлена неизвестная ранее закономерность обратимого изменения жизнедеятельности структурно-функциональных единиц живых организмов, насыщенных тяжёлыми инертными газами (Ar, Kr, Xe), в условиях отрицательных температур и повышенного давления, заключающаяся в том, что при охлаждении ниже 0°C клеток, тканей, органов, систем живых организмов, нагруженных давлением газовой среды аргона, криптона, ксенона выше атмосферного, происходит переход от активной жизнедеятельности к анабиозу ("клатратный анабиоз"), а при снятии условий отрицательных температур и повышенного давления, структурно-функциональные единицы остаются жизнеспособными и возвращаются к активной жизнедеятельности»
.
Библиография:
.
1. Абызов С.С., Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б. О возможности длительного пребывания жизнеспособных микроорганизмов в толще антарктического ледника // Экспериментальный анабиоз: Тез. докл. II Всес. конф. по анабиозу. – Рига, 1984. – С. 5-6.
3. Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. – Москва: Высш. шк., 1987. – 80 с.
4. Брушков А.В., Мельников В.П., Щелчкова М.В., Грива Г.И., Репин В.Е., Бреннер Е.В., Танака М. БИОГЕОХИМИЯ МЕРЗЛЫХ ПОРОД ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ // Криосфера Земли. – 2011. – Т. 15. – № 4. – С. 90-100.
5. Брушков А.В., Мельников В.П., Суховей Ю.Г., Грива Г.И., Репин В.Е., Каленова Л.Ф., Бреннер Е.В., Субботин А.М., Трофимова Ю.Б., Танака М., Катаяма Т., Утсуми М. Реликтовые микроорганизмы криолитозоны как возможные объекты геронтологии // Успехи геронтологии / ЭСКУЛАП. – СПб, 2009. – Т. 22 – № 2 – С. 253-258.
6. Буленков С.Е., Тюрин В.И., Самойлов Б.П. и др. Справочник пловца подводника. – Москва: Воениздат, 1977. – 255 с.
7. Буров Е.Н., Потапов В.Н., Макеев Г.Н. /Ксенон в анестезиологии.- Москва., "Пульс", 2000.- 389 с.
8. Бык С.Ш., Макагон Ю.Ф., Фомина В.И. Газовые гидраты. – Москва: Химия, 1980. – 296 с.
9. Волков В.Я., Родин В.В., Исангалин Ф.Ш. Образование клатратов ксенона как метод иммобилизации молекул воды в клеточных суспензиях // Экспериментальный анабиоз: Тез. докл. II Всес. конф. по анабиозу. – Рига, 1984. – С. 51-52.
10. Воробьёва Е.А., Хлебникова Г.М. Погребённые почвы зоны вечной мерзлоты — пул микроорганизмов, находящихся в состоянии анабиоза // Экспериментальный анабиоз: Тез. докл. II Всес. конф. по анабиозу. – Рига, 1984. – С. 54-55.
11. Глинка Н. Л. Общая химия. – Ленинград: Химия, 1971. – 712 с.
12. Голдовский А. М. Анабиоз и его практическое значение – Л.: // Наука, 1986. – 169 с.
13. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3-х т. Т. 3.: Пер. с Англ./Под ред. Р. Сопера. — М.: Мирп. 1990. — 376 с., ил.
14. Долгирева Ю. А., Формирование ансамбля воздушных гидратов в ледниковых покровах: автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. Физ.-мат. наук. – Казань, 2009. – 142 с.
15. Кирпатовский В.И. Основные проблемы криоконсервации органов // Общие проблемы биологии: Итоги науки и техники / ВИНИТИ. – Москва, 1987. – Т. 8. – С. 140-197.
16. Кованов В.В. Цель – химический анабиоз, или вторая жизнь формалина [Интервью] // Наука и жизнь. – 1985. – № 7. – С. 49-53
17. Крамер Ф. Соединения включения. [Пер. с нем.] – Москва: Иностранная литература, 1958. – 169 с.
19. Лазарев Н.В. Биологическое действие газов под давлением. – Ленинград, 1941. – 935 с.
20. Лаптев Д.С., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Соломина О.Н., Утемов С.В. ПРИМЕНЕНИЕ ИНЕРТНОГО ГАЗА КСЕНОНА ДЛЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины — 2014. — №2. — С. 251-253.
21. Манаков А. Ю. Клатратные гидраты при высоких давлениях – структура, состав, свойства // Автореф. дисс. на соискание учен. степ. докт. хим. наук. – Новосибирск, 2007. – 32 с.
22. Маэно Н. Наука о льде. [Пер. с яп.] – Москва: Мир, 1988. – 231 с.
23. Макаров А. Ф., Тоньшин А. А., Бонитенко Е. Ю. Способ сохранения органов и тканей в составе целостного организма в жидкости при температурах ниже 0°C под давлением в среде инертного газа // Патент на изобретение / (19) RU (11) 2 748 496 (13) C1 (51) МПК A01N 1/00 (2006.01)
24. Максимов Н. А. О вымерзании и холодостойкости растений. Экспериментальные и критические исследования // Изв. Лесн. ин-та. 1913. — Вып. 25. — С. 1-329.
25. Милованов В.К., Соколовская И.И., Смирнов И.В. Свойства живчиков млекопитающих сохранять биологическую полноценность после быстрого замораживания Н. Диплом на открытие №103. 1972.
26. Нессирио Б.А. Физиологические основы декомпрессии водолазов-глубоководников. – Санкт-Петербург: ООО «Золотой век», 2002. – 448 с.
27. Никитин Б.А. Исследования в области молекулярных соединений благородных газов // Избранные труды. – Москва; Ленинград: Издательство АН СССР, 1956. – 344 с.
28. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. – Москва: Изд-во МГУ, 1980. – 150 с.
29. Родин В.В., Архангельский А.Н., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Получение клатратов ксенона в воде и исследование их свойств импульсным методом ЯМР. // Криобиология и криомедицина. — 1984. — Вып. 14. — С. 8 – 11.
30. Родин, Виктор Васильевич. Характеристика биотехнологических дисперсионных систем методами магнитного резонанса : автореферат дис. ...доктора химических наук : 02.00.11, 02.00.06/МГУ им. М.В. Ломоносова Москва, 1997 41 с. : 9 97-4/3954-5 9 97-4/3955-3
31. Сведенцов Е.П., Лаптев Д.С., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Шерстнёв Ф.С., Князев М.Г. Оценка криопротекторных свойств аргона // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований — 2012. — №4. — С. 55.
32. Смолин В.В., Соколов Г.М., Павлов Б.Н. Водолазные спуски до 60 метров и их медицинское обеспечение. – Москва: Фирма «Слово», 2003. – 626 с.
33. Соколовская Е.М., Вовченко Г. Д., Гузей Л. С. Общая химия. – Москва: Изд-во Моск. ун-та, 1980. – 726 с.
35. Тимофеев Н. Н. Искусственный гипобиоз. – Москва: Медицина, 1983. – 192 с.
36. Утешев В. К., Швирст Н. Э., Манохин А. А., Волынкин Л. И., Аверин А. С., Щербаков П. В., Тельпухов В. И., Фесенко Е. Е. Устройство и способ для экспериментального изучения и расширения временных границ сверхглубокой гипотермии // Патент на изобретение / RU (11) 2 688 722 (13) C1 (51) МПК A61H31/00 (2006.01)
37. Ушатинская Р.С. Скрытая жизнь и анабиоз. – Москва: Наука, 1990. – 182 с.
38. Фастовский В.Г., Ровинский А.Е., Петровский Ю.В. Инертные газы. – Москва: Атомиздат, 1964. – 303 с.
39. Финкельштейн Д. Н. Инертные газы. – Москва: Наука, 1979. – 200 с.
40. Худяков А.Н., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н. Устройство для криоконсервирования клеточных взвесей в атмосфере газовых протекторов // БИОФИЗИКА ЖИВОЙ КЛЕТКИ — 2014. — том 10. — С. 209-211.
42. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Кирпатовский В.И. Фармакологическая защита трансплантата. – Москва: Медицина, 1983. – 232 с.
43. Шумаков В.И. О путях повышения эффективности консервации органов методом глубокого замораживания // Актуальные вопросы консервации органов: Научный обзор. – Часть 3. – Москва, 1980. – С. 70-78.
44. Шумаков В.И., Штенгольд Е.Ш., Онищенко Н.А. Консервация органов. – Москва: Медицина, 1975. – 252 с.
49. Щербаков П. В., Тельпухов В. И. Бессмертие под газом // Химия и жизнь. – 2006. – № 8. – С. 34-39.
50. Щербаков П.В., Тельпухов В.И. Охладить, но не замораживать // Наука и жизнь. – 2018. – № 1. – С. 74-77
51. Видео: «Обратимая глубокая гипотермия крысы»
52. Abbott С.P. A technique for heart transplantation in the rat. - Arch. Surg., 1964, 89, 4, 645-652.
53. Derwall M., Coburn M., Rex S., Hein M., Rossaint R., Fries M. Xenon: recent developments and future perspectives // Minerva Anestesiol. 75. 2009. P. 37-45.
55. Groenewald I.V., Vanzybl I.W., Weber H.W., Murphy G.P. Comparison of perfusion and non-perfusion of preserved baboon kidneys with and without oxygen. — Trans Amer Soc Artif Intern Organs. 1969. v. 15. p. 220-224.
56. Lions G.W., Dietzman R.H., Lillehei R.C. On the mechanism of preservations oxygen. — Trans Amer Soc Artif Intern Organs. 1966. XII: 236.
57. Mendes F., Gomes M. Xenon: pharmacology and clinical use // Revista Brasileira de Aneste-siologia, 2003/ 53/ P. 535-542.
58. Pauling L. A molecular theory of general anesthesia // Science. – 1961. v. 134. – N3471. – p. 15-21.
59. 17. Prehoda Robert W., Suspended animation: the research possibility that may allow man to conquer the limiting chains of time // Chilton Book Company, Philadelphia, 1969, pp81-86.
60. Rassat J.P., Haxne I.I. Evaluation of kidney preservation with the use hyperbaric oxygen. — «Brit. J. Surg.», 1967, v. 54, p. 361 – 368.
61. Rey L.R. Study of the freezing and drying of tissues at very low temperatures // Recent research in freezing and drying / Ed. A.S. Parkes, A.U. Smith. Blackwell, 1960/ P. 40-62.
.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
.
«ЗАМАНЧИВАЯ ПЕРСПЕКТИВА ПРИМЕНЕНИЯ КЛАТРАТНОГО ГИПОБИОЗА И АНАБИОЗА»
.
«Япония выделяет $921 млн. для исследовательских проектов, включая искусственную гибернацию»
.
* * * * * * В ПРОДОЛЖЕНИЕ ТЕМЫ * * * * * *
.
«Клатратный анабиоз»: приглашаем в соавторы научного открытия
.
.