В лабораторной работе каждая задача уникальна. Универсального «фермента на все случаи жизни» не существует. Нужно то амплифицировать крохотный фрагмент ДНК, то работать с «капризной» РНК, то добиться максимальной точности для клонирования.
Компания «Альгимед Техно» разработала линейку высококачественных ферментов, чтобы вы могли выбрать свой набор под конкретные методики и протоколы:
- Термостабильные полимеразы (Taq, Pfu) для классической и высокоточной ПЦР
- Уникальная Elaine Taq-полимераза, позволяющая проводить прямую амплификацию ДНК из крови
- Обратная транскриптаза для работы с РНК, включая вирусные геномы
- Bst-полимераза для быстрой изотермической амплификации даже в полевых условиях
- Протеиназа K для безупречно чистых образцов ДНК/РНК, свободных от ингибиторов
Соберите свою идеальную реакцию с ферментами ALZYME!
ДНК-полимераза «ALZYME Taq», производитель «Альгимед Техно»
ДНК-полимераза «ALZYME Taq» предназначена для синтеза молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) путём комплементарного копирования родительских цепей ДНК.
Проблемы, которые решают полимеразы
Проблема ничтожно малого количества материала: в образце (капля крови, кусочек ткани, мазок из носа) содержится очень мало молекул ДНК\РНК. Этого количества абсолютно не хватает для большинства анализов – его просто невозможно «увидеть» или «прочитать».
Решение: ДНК-полимераза
Используя ДНК-полимеразу, например, Taq-полимеразу, ученые могут в пробирке за несколько часов размножить (амплифицировать) нужный участок ДНК в миллиарды раз. Благодаря этому изначально «невидимый» фрагмент становится легко детектировать и анализировать.
Преимущества «ALZYME Taq»
- Термостабильность
- Процессивность до 5 тыс. п.н., высокая скорость синтеза
- Оптимальная температура работы
- Наличие 5´-3´ полимеразной активности и 5´-3´ экзонуклеазной активности
- Доступность и стоимость
ДНК-полимераза «ALZYME Elaine Taq», производитель «Альгимед Техно»
ДНК-полимераза «ALZYME Elaine Taq» предназначена для синтеза молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) путём комплементарного копирования родительских цепей ДНК.
«ALZYME Elaine Taq» — уникальная рекомбинатная ДНК-полимераза Taq, разработанная в компании “Альгимед Техно”. Аналогично обычной ДНК-полимеразе «ALZYME Taq» решает проблему ничтожно малого количества материала. Однако, имеет ряд дополнительных преимуществ:
- Высокая скорость амплификации
- Устойчивость к ингибиторам ПЦР, что позволяет проводить прямую амплификацию ДНК из цельной крови, сухих пятен крови и плазмы
Обратная транскриптаза «ALZYME RT», производитель «Альгимед Техно»
Обратная транскриптаза «ALZYME RT» предназначена для синтеза первой цепи кДНК с РНК-матрицы.
Проблема «перевода» с языка РНК на язык ДНК
Многие вирусы (например, коронавирус или ВИЧ) хранят свою информацию в РНК. Большинство лабораторных методов работы с нуклеиновыми кислотами позволяют работать только с более стабильной молекулой ДНК, нежели РНК.
Решение: обратная транскрипция
С помощью фермента обратной транскриптазы ученые переводят (транскрибируют) РНК в более удобную для работы и стабильную ДНК-копию (кДНК). Эту кДНК уже можно использовать в ПЦР (ПЦР в реальном времени).
Преимущества «ALZYME RT»
- Синтез фрагментов кДНК длиной до 12000 п.н.
- Повышенная термостабильность. Фермент активен при 55 °С
- Высокая точность и процессивность в сравнении с MMLV ревертазой
- Позволяет работать с информацией, закодированной в РНК
- Изучение активности генов в реальном времени
ДНК-полимераза «ALZYME Pfu», производитель «Альгимед Техно»
ДНК-полимераза «ALZYME Pfu» предназначена для синтеза молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) путём комплементарного копирования родительских цепей ДНК в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Проблема невозможности прочитать длинные последовательности, накопление ошибок
Стандартные полимеразы (например, Taq-полимераза из термофильных бактерий), используемые в ПЦР, не обладают функцией проверки и исправления ошибок. Они работают быстро, но при копировании ДНК вставляют неверный нуклеотид:
- Для коротких фрагментов это не критично: количество ошибок на коротком участке невелико.
- Для длинных фрагментов (более 5-10 тыс. пар оснований) эта проблема становится фатальной. Ошибки накапливаются с каждым циклом амплификации, в итоге получается не точная копия исходного фрагмента, а молекула с множеством мутаций, непригодная для большинства исследований (клонирования, секвенирования).
Решение: использование высокоточных Pfu-полимераз
Pfu-полимераза (из Pyrococcus furiosus) – это фермент, который обладает 3´-5´ экзонуклеазной активностью, то есть возможность исправлять ошибки.
Фермент останавливается, движется назад, вырезает неправильный нуклеотид и вставляет правильный. В результате точность копирования у Pfu в 10-50 раз выше, чем у Taq. Это значительно снижает вероятность появления мутаций в длинной амплифицированной последовательности.
Преимущества «ALZYME Pfu»
- Максимально высокая точность синтеза
- Позволяет эффективно амплифицировать фрагменты ДНК до 20000 п.н.
- Повышенная скорость амплификации
- Устойчивость к ингибиторам ПЦР
- Амплификация сложных (GC-богатых) последовательностей
ДНК-полимераза «ALZYME HSTaq», ДНК-полимераза «ALZYME HSPfu», ДНК-полимераза «ALZYME Elaine HSTaq»
Hot-Start (HS) полимеразы «ALZYME HSTaq», «ALZYME HSPfu», «ALZYME Elaine HSTaq» решают одну ключевую проблему, которая возникает в самом начале проведения ПЦР.
Проблема: Неспецифическая амплификация и образование праймер-димеров
При подготовке ПЦР-смеси на холоде или при комнатной температуре все компоненты находятся вместе: ДНК-матрица, праймеры, нуклеотиды (dNTP) и полимераза.
- Праймеры – это короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, которые должны специфично присоединиться только к строго комплементарным участкам на матрице
- Обычная полимераза уже на этом этапе обладает некоторой остаточной активностью
Что происходит?
При низкой температуре праймеры могут неспецифично и непрочно связываться:
1) друг с другом (образуя так называемые «праймер-димеры»)
2) с неправильными, но частично комплементарными участками на матричной ДНК.
Полимераза сразу начинает работу с этих неидеальных комплексов и синтезирует ненужные, нецелевые продукты. При старте полимеразной цепной реакции эти неправильные продукты тоже амплифицируются, конкурируя с целевым продуктом за ресурсы (праймеры, нуклеотиды, полимеразу). В результате:
- Низкий выход нужного продукта (он «проигрывает» в конкуренции)
- Множество посторонних продуктов на электрофорезе («лестница» из полос)
- Реакция совсем не прошла
Решение: Hot-Start полимеразы
Полностью блокировать активность полимеразы до тех пор, пока в термоциклере не будет достигнута высокая температура, необходимая для специфичного отжига праймеров (обычно >60ºС).
Как это реализовано?
Фермент искусственно удерживают в неактивном состоянии с помощью одного из механизмов:
- Химическая модификация: фермент ковалентно модифицирован химической группой, которая мешает ему работать. Высокотемпературная инкубация разрушает эту химическую блокировку.
- Аптамеры: синтетические олигонуклеотиды или белки, которые связывают и ингибируют полимеразу, пока не будет достигнута температура денатурации.
- Антитела: специфические антитела связываются с активным центром полимеразы и блокируют его. При первом нагревании до 95 ºС антитела необратимо денатурируют (разрушаются), освобождая активный фермент.
Преимущества Hot-Start полимераз «ALZYME HSTaq», «ALZYME HSPfu», «ALZYME Elaine HSTaq»
- Высокая специфичность амплификации
- Повышенная чувствительность
- Удобство и воспроизводимость
- Универсальность применения
ДНК-полимераза «ALZYME Bst», производитель «Альгимед Техно»
ДНК-полимераза «ALZYME Bst» для классической петлевой изотермической реакции амплификации (LAMP), обладающая вытесняющей активностью. Bst-полимераза решает несколько ключевых проблем в молекулярной биологии и диагностике, делая процессы амплификации ДНК более простыми, быстрыми и доступными.
Проблемы, которые позволяет преодолеть Bst-полимераза
Решение проблемы #1: Зависимость от дорогостоящего оборудования (термоциклеров). Bst-полимераза работает изотермически (при постоянной температуре 60-65 ºС. Это устраняет необходимость в многократных циклах нагревания и охлаждения, а значит, и в дорогом термоциклере. Реакцию можно проводить в простом термостате или даже в водяной бане.
Решение проблемы #2: Низкая скорость стандартной ПЦР. Благодаря высокой процессивности и активности, Bst-полимераза обеспечивает очень быструю амплификацию, меньше часа, что значительно ускоряет получение результата по сравнению с многочасовой ПЦР.
Решение проблемы #3: Сложность диагностики в полевых условиях (вне лаборатории). Фермент стабилен и пригоден для лиофилизации (сушки). Это позволяет создавать на его основе готовые к использованию тест-системы. Такие тесты можно хранить без холодильника и использовать для диагностики прямо на месте.
Решение проблемы #4: Наличие ингибиторов в образцах. Bst-полимераза обладает повышенной устойчивостью к ингибиторам ПЦР (компонентам крови, слизи, почвы и т.д.), которые часто присутствуют в клинических и природных образцах.
Решение проблемы #4: Низкая эффективность амплификации сложных участков ДНК. Мощная вытесняющая активность позволяет ферменту эффективно амплифицировать мишени со сложной вторичной структурой, с которыми не справляются полимеразы без этой функции.
Преимущества ДНК-полимеразы «ALZYME Bst»
- Высокая активность «вытеснения цепи» - фермент самостоятельно разделяет двойную цепь ДНК во время синтеза, устраняя необходимость в стадии денатурации (95 ºС). Это основа изотермических методов амплификации
- Экспресс-амплификация
- Стабильность и портативность
- Визуальная детекция результатов
Протеиназа «ALZYME K», производитель «Альгимед Техно»
Протеиназа «ALZYME K» предназначена для очистки ферментативных смесей и клеточных лизатов от нежелательных белков при выделении РНК/ДНК. Протеиназа К решает проблему наличия белков в образце, которые мешают чистоте и эффективности последующих реакций. Она разрушает белки до аминокислот и коротких пептидов, очищая целевые нуклеиновые кислоты.
Проблемы, которые позволяет преодолеть протеиназа «ALZYME K»
Решение проблемы #1: Инактивация нуклеаз (РНКаз и ДНКаз). Нуклеазы — это ферменты, которые моментально разрушают ДНК или РНК после выделения, делая образец непригодным для анализа. Протеиназа К эффективно разрушает эти нуклеазы, сохраняя целостность и качество выделяемых нуклеиновых кислот. Это особенно критично для работы с РНК, которая крайне чувствительна к РНКазам.
Решение проблемы #2: Разрушение клеточных структур и тканей. Клеточные мембраны, ядерная оболочка и внеклеточный матрикс тканей состоят из белков и липидов, которые физически защищают ДНК/РНК от выделения. Протеиназа К переваривает эти белковые структуры, высвобождая нуклеиновые кислоты и делая их доступными для последующей экстракции. Это позволяет работать со сложными образцами: тканями, кровью, бактериями.
Решение проблемы #3: Удаление гистонов и других ДНК-связывающих белков. В клетке ДНК плотно упакована с помощью гистоновых и негистоновых белков. Для получения чистой ДНК необходимо удалить эти белки. Фермент эффективно расщепляет гистоны, позволяя выделить высококачественную, неповрежденную ДНК.
Решение проблемы #4: Повышение чистоты образца для ПЦР и секвенирования. Остаточные белки в образце могут быть мощными ингибиторами последующих ферментативных реакций (ПЦР, обратной транскрипции, рестрикции), приводя к ложноотрицательным результатам. Обработка протеиназой К на этапе выделения устраняет эти ингибиторы, значительно повышая эффективность и воспроизводимость результатов.
Решение проблемы #5: Работа в жестких условиях. Многие ферменты быстро разрушаются в присутствии детергентов (SDS) или при высоких температурах, которые используются для лизиса клеток. Протеиназа К чрезвычайно стабильна и активна в условиях, где другие протеиназы инактивируются.
Протеиназа «ALZYME K» стабильна в мочевине, SDS, ЭДТА. Сохраняет активность в диапазоне рН 6,5–9,5 и при относительно высоких температурах (оптимально 50–65 °С), функционирует в присутствии хаотропных солей и детергентов.
Преимущества протеиназы «ALZYME K»
- Широкая субстратная специфичность
- Высокая стабильность в жестких условиях
- Совместимость с большинством протоколов выделения ДНК/РНК
- Универсальность применения
О производителе: «Альгимед Техно» - научно-производственная биотехнологическая компания, которая разрабатывает и производит реагенты, тест-системы, расходные материалы и оборудование для медицины, фармацевтики, науки, криминалистики, ветеринарии, пищевой отрасли.
"Альгимед Техно" сегодня:
✔ 150+ сотрудников
✔ 10+ кандидатов наук в R&D
✔ 4000 м² производственные площади
✔ 2 производственные площадки (Россия, Беларусь)
✔ 1000+ товарных позиций
✔ 10+ патентов
✔ 12 линеек продукции
Для приобретения ферментов «ALZYME» и получения дополнительной информации обратитесь в ООО «Альгимед»: mail@algimed.ru | +7 499 682 61 09