Assassin’s Creed: Brotherhood вышла в 2010 году и продолжила историю Эцио Аудиторе сразу после событий второй части. На этот раз действие сосредоточено в одном городе — Риме, а история рассказывает о том, как Эцио борется с семьёй Борджиа и превращает Братство ассасинов в настоящую силу. После событий Assassin’s Creed II, Эцио возвращается в свою виллу в Монтериджони. Он завоевал уважение Братства и стал мастером-ассасином, но мир длится недолго.
Вскоре на город нападает армия Чезаре Борджиа, сына Родриго Борджиа (того самого Папы из второй части). Монтериджони разрушена, а Яблоко Эдема — похищено. Эцио чудом выживает и решает отомстить. Эцио отправляется в Рим, столицу Папской державы и гнездо Тамплиеров. Здесь власть полностью принадлежит семье Борджиа. Город разорён, народ угнетён, а ассасины почти уничтожены. Эцио понимает, что один он ничего не изменит, и решает создать новое Братство. Он собирает союзников, спасает заключённых, обучает молодых ассасинов и постепенно превращает