Позвольте представить Вашему вниманию важные изменения произошедшие в подходах к оценке ооцитов и эмбрионов человека, используемые во вспомогательных репродуктивных технологиях.
Каковы в настоящее время рекомендуемые критерии морфологической оценки ооцитов, зигот и эмбрионов?
В выдержках из консенсусного документе ESHRE/Alpha Scientists in Reproductive Medicine представлено несколько новых рекомендаций по оценке морфологии ооцитов и эмбрионов, а также по ранжированию эмбрионов для переноса.
Давайте с ними кратко ознакомимся.
Оценка развития человеческого эмбриона — важная, но сложная задача в лаборатории ЭКО. Эмбриологи оценивают эмбрионы, чтобы выбрать наиболее жизнеспособные для внутриматочного переноса, криоконсервации или биопсии для преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). С первых дней ЭКО в 1980- х годах, когда эмбрионы оптимистично оценивались как «хорошие, очень хорошие или очень-очень хорошие» (личное сообщение Жака Коэна), было выявлено и изучено относительно большое количество ранних морфологических особенностей эмбриона на предмет их связи с жизнеспособностью, имплантацией, живорождением и хромосомным статусом. Тем не менее, оценка морфологии остается в значительной степени субъективной и подвержена меж- и внутриисследовательской и межлабораторной вариабельности.
За последнее десятилетие наиболее значительным достижением в оценке эмбрионов стало внедрение технологий покадровой микроскопии (TLT). Это привело к появлению «морфокинетики». Как следует из самого термина, морфокинетика представляет собой интеграцию морфологии (формы и структуры эмбрионов) с кинетикой (динамикой их развития), обеспечивая комплексную основу для понимания и оценки развития эмбрионов in vitro. Эти технологии позволяют непрерывно наблюдать за развитием эмбрионов с минимальными манипуляциями или нарушениями культуры.
Опубликованы сотни статей по оценке эмбрионов. Большинство этих исследований ретроспективны и неоднородны по ряду ключевых параметров, включая популяцию пациентов, показатели исходов, контроль за факторами, которые могут помешать благоприятному исходу, лабораторные процедуры и условия культивирования эмбрионов. Более того, на результаты морфокинетических исследований, как и на классические морфологические исследования, могут влиять возраст матери, вредные привычки (в частности, курение), протоколы стимуляции яичников и методы оплодотворения, а также другие факторы. Тем не менее, наблюдения ТЛТ внесли значительный вклад в наше понимание событий развития, а оценки морфологии теперь дополнены морфокинетикой.
Более десяти лет назад специалисты Alpha Scientists in Reproductive Medicine (ALPHA) и специальная исследовательская группа ESHRE по эмбриологии объединились для разработки Стамбульского консенсуса по оценке ооцитов, зигот и эмбрионов. Стамбульский консенсус (2011 г.) установил общие критерии и терминологию для оценки ооцитов, зигот и эмбрионов, которые в данной работе обновлены на основе тщательного изучения, компиляции, анализа и интерпретации данных, опубликованных за прошедшие годы. Что особенно важно, новые рекомендации включают некоторые особенности морфокинетики эмбрионов, выявленные после внедрения ТЛТ и способные дать информацию и дополнение к подходу статического наблюдения.
Терминология.
Эмбриологи регулярно принимают решения о дальнейшей судьбе ооцитов и эмбрионов, то есть о том, пригодны ли они к клиническому использованию или должны быть уничтожены. Клиническое использование ооцитов и эмбрионов определяется как их использование для процедур ЭКО/ИКСИ, биопсии/ПГТ, криоконсервации, переноса и донорства. В обновлённом наборе рекомендаций рабочая группа использовала термины «градация эмбрионов», «ранжирование» и «отбор».
Градация эмбрионов — это оценка эмбрионов с использованием определённого набора критериев для присвоения им оценки качества: количества, размера и формы бластомеров, степени фрагментации, морфологии и расширения внутренней клеточной массы (ВКМ) и трофэктодермы (ТЭ) и т. д.
Ранжирование эмбрионов — это процедура определения приоритетности клинически пригодных эмбрионов на основе классификации и других критериев оценки, от наиболее до наименее подходящих для переноса. Эмбрионы ранжируются в соответствии с их предполагаемым потенциалом имплантации и развития, которые определяются морфологическими и, при наличии данных, генетическими факторами. Это определение приоритетности переноса эмбрионов в первую очередь.
Отбор эмбрионов для переноса включает в себя оценку ранга и другие факторы, влияющие на выбор эмбрионов для переноса в матку. Цель — выбрать эмбрион(ы) с наибольшей вероятностью успешного наступления беременности и рождения живого ребенка.
Современные данные о критериях оценки ооцитов и эмбрионов.
1. Ожидаемые сроки развития эмбриона.
Консенсусные точки:
· Стандартизированное время наблюдений критически важно для достоверного сравнения результатов, полученных в разных лабораториях, с учётом условий культивирования, пациентов и других переменных. Оно должно устанавливаться относительно времени оплодотворения и единообразно указываться в часах после оплодотворения. Существует внутренняя изменчивость во времени всех биологических процессов; предлагаемое время наблюдения отражает время, в течение которого в большинстве случаев происходят соответствующие стадии развития, при этом признавая наличие искажающих и влияющих факторов, включая человеческую субъективность.
· Общепризнано, что питательные среды и системы культивирования в целом оказывают значительное влияние на морфокинетику эмбрионов; соответственно, их влияние следует учитывать в сравнительных исследованиях.
· Каждой лаборатории рекомендуется разрабатывать и анализировать собственные наборы данных для определения соответствующих сроков. Данные, полученные другими лабораториями, могут быть применимы или не применяться в целом.
2. Ооцит.
Консенсусные точки:
· Гигантские ооциты следует исключить из клинического использования.
· Использование мелких/крупных ооцитов и ооцитов, «спасенных» с помощью IVM, следует документировать в прогностических целях и для отслеживания из-за их, по-видимому, более низкого потенциала развития.
· Эмбрионы, полученные из ооцитов MII без крупных или множественных вакуолей, кластеров гладкого эндоплазматического ретикулума, без непропорциональных форм и без очень крупных полярных телец, должны иметь приоритет для клинического использования.
· Пренатальное наблюдение и наблюдение за детьми, рожденными из ооцитов с атипичными фенотипами и «спасенных» с помощью IVM, требуют внимания.
3. Стадия зиготы.
Консенсусные точки:
· Данные показывают значительную пластичность оплодотворения у человека и создают основу для обновленных рекомендаций, касающихся статической оценки оплодотворения.
· Сроки наблюдения. При статическом наблюдении оценку количества пронуклеусов следует проводить на 16 – 17-м часу после оплодотворения, как в случаях ЭКО, так и ИКСИ, чтобы минимизировать вероятность ошибочной классификации зигот, подвергшихся относительно раннему распаду пронуклеусов, как неоплодотворённых ооцитов. Проверка на сингамию методом статического наблюдения, упомянутая в Стамбульском консенсусе (2011 г.), не рекомендуется, поскольку время распада пронуклеусов невозможно точно определить.
· Морфологические особенности. Многочисленные зиготические характеристики, включая размер зиготы, размер протоплазматического узла, положение протоплазматического узла и паттерн нуклеопротеидного узла (NPB), могут быть связаны с качеством эмбриона и клиническим исходом. Однако их использование в качестве биомаркеров затруднено как минимум двумя факторами: (I) недостаточностью данных (например, размером протоплазматического узла) и (II) внутренней морфологической изменчивостью в течение коротких промежутков времени (паттерн нуклеопротеидного узла), не поддающейся статическому наблюдению. Отсутствие сопоставления протоплазматического узла встречается очень редко, но тесно связано с нарушением развития бластоцисты.
· Отсутствие цитоплазматического ореола влияет на формирование бластоцисты, но не на скорость имплантации после переноса бластоцисты. Следовательно, отсутствие гало может быть использовано для ранжирования, но не для исключения эмбрионов при переносе эмбрионов на 3-й день.
· Количество PN . При статическом наблюдении пронуклеусы могут не быть видны при проверке оплодотворения, и тем не менее может происходить нормальное развитие эмбриона. Это может быть объяснено данными TLT, которые показывают, что значительная часть зигот 2PN подвергается распаду пронуклеусов в более ранние сроки, чем интервал проверки оплодотворения, рекомендованный первоначальным Стамбульским консенсусом (2011). В таких случаях наличие PBII должно сопровождать оплодотворение 2PN и, следовательно, использоваться в качестве критерия оценки. Хотя эти зиготы можно отнести к категории 0PN, при культивировании они могут давать нормальные лабораторные и клинические результаты. Поэтому термин «неоплодотворённый» или «0PN» в таких случаях использовать не следует. Вместо этого для зигот, развивающихся нормально без подтверждения оплодотворения, более подходящим вариантом может быть «PN не наблюдается».
· Предварительные данные ПГТ-А предполагают, что значительная доля зигот 1PN и некоторые зиготы 3PN могут быть двуродительскими диплоидными. Кроме того, всё больше исследований сообщают о нормальном рождении живых детей из зигот 1PN, полученных как в циклах ИКСИ, так и ЭКО. В совокупности эти данные подтверждают необходимость осторожного клинического использования зигот 1PN, сочетающего культивирование бластоцисты и, если доступно, технологию ПГТ-А, подходящую для оценки двуродительской диплоидии. Клиническое использование зигот 3PN не рекомендуется на основании имеющихся данных. Зиготы 2PN с одним дополнительным микропронуклеусом (2.1PN) встречаются относительно редко. Однако они также могут иметь диплоидный генотипа и приводят к нормальному живорождению. Возможно их клиническое применение, особенно в сочетании с технологией ПГТ-А. В целом, возможное клиническое применение зигот 1PN и 2.1PN следует обсуждать с клинической бригадой и пациентом и регулировать в соответствии с утверждённой внутренней политикой.
4. Стадия дробления.
Консенсусные точки:
· Оценка эмбрионов на стадии дробления должна включать количество клеток, степень и причину степени(например, 4 клетки, степень 2, фрагментация), как ранее было согласовано в Стамбульском консенсусе (2011 г.).
· Двухклеточные эмбрионы на 1-й день, 4-клеточные эмбрионы на 2-й день и 8-клеточные эмбрионы на 3-й день, демонстрирующие <10% фрагментации, мононуклеацию и размер клеток, специфичный для конкретной стадии, должны быть в приоритете в случае переноса на стадии дробления или криоконсервации.
· Нет значительных доказательств, подтверждающих влияние на потенциал имплантации эмбрионов на стадии дробления с такими нетипичными характеристиками, как пространственная дезорганизация, вакуоли, цитоплазматическая зернистость и аномалия зонального слоя, и поэтому они считаются подходящими для клинического использования. Тем не менее, следует рассмотреть возможность расширенного культивирования таких эмбрионов как способ дальнейшего отбора на жизнеспособность и оценки.
· Раннее дробление: важность оценки раннего дробления для прогнозирования вероятности успеха окончательно не установлена. Однако подобная оценка может дать дополнительную информацию о других характеристиках, таких как двуядерность/многоядерность и размер клеток. Оценка раннего дробления с помощью ТЛТ может использоваться для выявления аномальных ранних дроблений, таких как прямое дробление, обратное дробление и нерегулярное хаотичное деление.
· Фрагментация: относительная степень фрагментации определялась как: отсутствующая или минимальная (<10%), слабая (<25%) или сильная (>25%). Процентные значения основаны на клеточных эквивалентах, так что для 4-клеточного эмбриона 25% фрагментации будет соответствовать одному бластомеру по объёму.
· Количество бластомеров на 2-й/3-й день: в настоящее время ожидаемое количество клеток на 2-й день - 4, и 8 клеток на 3-й день. Однако это может зависеть от точного времени наблюдения и условий культивирования.
· Размер клетки: у эмбрионов на стадиях 2, 4 и 8 клеток бластомеры должны быть одинакового размера. Для всех остальных стадий развития можно ожидать разницы в размерах, соответствующей стадии развития, поскольку фаза дробления еще не завершена.
· Многоядерность: Истинная многоядерность (трое ядер в одной или нескольких клетках) связана со сниженным потенциалом имплантации и повышенным числом хромосомных аномалий. Бинуклеация на 2-й день на стадии 4 клеток не обязательно является отрицательным признаком, но необходимы дополнительные доказательства. Лаборатории должны регистрировать частоту и различать бинуклеацию, многоядерность и микронуклеацию в каждом эмбрионе, а в идеале — статус нуклеации каждого бластомера в каждом эмбрионе. При наличии возможности многоядерность следует оценить с помощью ТЛТ.
· Технология покадровой съёмки: для разработки алгоритмов прогнозирования имплантации и живорождения были проанализированы большие наборы данных, включая данные о времени отдельных этапов развития. Однако в настоящее время имеется ограниченное количество качественных доказательств улучшения клинических результатов после отбора эмбрионов методом ТЛТ. ТЛТ позволяет оценивать кинетические переменные, такие как быстрое дробление, прямое дробление и обратное дробление. Эти данные использовались для селекции эмбрионов, и было продемонстрировано, что некоторые нетипичные паттерны дробления, такие как прямое дробление до трёх клеток, отрицательно влияют на развитие эмбриона. Эти события в большинстве случаев были бы пропущены при статических наблюдениях.
· Компактизация: на основании нескольких исследований можно сделать вывод, что начало компактизации до 8 клеток, по-видимому, отрицательно влияет на формирование бластоцисты, тогда как компактизация от 8 клеток и далее может быть положительным показателем и потенциально может использоваться как дополнительный инструмент отбора на этой стадии.
5. Стадия морулы.
Консенсусные точки:
· Эмбрионы 4-го дня с полной компактизацией или ранним образованием кавитации следует отдавать приоритет при переносе или витрификации на 4-й день.
· Эмбрионы с частичной компактизацией могут формировать бластоцисты и должны рассматриваться для клинического использования. Длительное культивирование следует рассмотреть возможность дальнейшей оценки этих эмбрионов.
6. Стадия бластоцисты (дни 4–7).
Консенсусные точки:
· В конечном итоге, цель классификации бластоцист – это ранжирование по порядку использования. Для оценки бластоцисты следует использовать систему оценок Гарднера. Эта система отличается от предыдущей консенсусной классификации использованием букв для градаций ICM/TE и добавлением дополнительных стадий расширения (например, вылупившаяся бластоциста). Нежизнеспособные бластоцисты следует классифицировать как «D», а не как «C», на основании дегенеративных признаков или отсутствия отчетливой внутренней клеточной массы. Общие характеристики, которые четко связаны с потенциалом имплантации, включают день формирования бластоцисты (дни 4–7), стадию расширения (3, 4, 5, 6) и характеристики ICM (A, B, C) и TE (A, B, C).
· Бластоцисты с ICM и/или TE степени C и бластоцисты 7-го дня могут быть жизнеспособными и могут считаться подходящими для клинического использование.
· Бластоцисты с двумя ВКМ, указывающими на потенциальную возможность монозиготной двойни, не следует переносить без тщательного консультирования пациента.
· Определение относительной важности каждой переменной требует систематического многомерного анализа с большим набором данных и еще больше усложняется при оценке свежих и замороженных нетестированных и эуплоидных бластоцист.
7. Продолжительность культивирования эмбрионов и частота оценок: безопасность против эффективности.
Консенсусные точки:
· Длительное культивирование эмбрионов является общепринятой и стандартной практикой.
· Длительность культивирования эмбрионов и частота статических наблюдений за эмбрионами должны соответствовать оборудованию лаборатории и навыкам персонала, обеспечивая минимальные изменения условий культивирования, которые могут повлиять на развитие эмбрионов.
Заключение.
В настоящем консенсусном документе представлены обновленные рекомендации по критериям и терминологии для оценки развития ооцита, зиготы, эмбриона на стадии дробления, морулы и бластоцисты, основанные на тщательном обзоре данных, накопленных за последнее десятилетие.
Критическая информация, полученная в результате применения ТЛТ, дала толчок к пересмотру сроков этапов развития, более пристальное внимание к влиянию методов оплодотворения на ранний эмбриогенез и представление более широкого спектра атипичной морфологии, обнаруженной с помощью покадровой съемки.
Обобщенные рекомендации направлены на продвижение стандартизированных методов оценки эмбрионов для лучшего прогнозирования жизнеспособности и оптимизации ранжирования и отбора эмбрионов для клинического использования. Несмотря на прогресс последнего десятилетия, сохраняется ряд пробелов в знаниях относительно клинической ценности конкретных морфологических и морфокинетических параметров, которые требуют дальнейшего изучения и анализа.
Несомненно, следующее десятилетие принесет более широкое внедрение ИИ в лаборатории ВРТ, что позволит решить извечную сложную проблему отбора жизнеспособных гамет и эмбрионов.
Наконец, объединяя опыт и знания различных учреждений и географических регионов, международные совместные усилия, такие как те, что представлены в этом консенсусном документе, могут способствовать улучшению согласованности исследований, клинической практики и большинства что особенно важно, результаты для пациентов, обращающихся за помощью к вспомогательной репродукции.