Перепечаев К.А., ветеринарный офтальмолог, микрохирург, к.б.н.
Оригинальная статья: «КЛИНИЧЕСКИЕ ФОРМЫ, ПАТОГЕНЕЗ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КОШЕК» была впервые опубликована в 2005 году в журнале «БИО - Ветеринарная клиника», Екатеринбург, 2005, №7, С.15 – 18; №8, С.6 – 10.
Пути передачи инфекции
Естественный путь заражения вирусом FHV-1 является контактным через назальные, оральные или конъюнктивальные выделения, хотя в экспериментальных исследованиях были обнаружены и другие пути распространения. Например, у беременных самок внутривлагалищная инстилляция вируса приводит к вагиниту и врожденной инфекции котят, а внутривенное заражение - к трансплацентарной инфекции и выкидышам. Тяжесть инфекции детерминируется как инфекционностью инокулируемого вируса, так и иммунным статусом животного и практически не зависит от наличия вторичной бактериальной микрофлоры.
Может также произойти косвенная передача вируса через зараженные секреторные выделения в клетках, посуду для еды и для проведения чистки, персонал и так далее. Особенно внутри закрытых пространств кошачьего питомника. Тем не менее, ввиду того что вирусы имеют относительно короткий срок существования вне организма кошки, внешняя обстановка, как правило, не является долговременным источником распространения вируса. Аэрозольный вид передачи вируса, как полагают, не имеет большой значимости, так как существует определенное свидетельство, что кошка не выделяет инфекционную аэрозоль респираторных вирусов во время обычной деятельности системы дыхания. Однако чихание может привести к выбросу больших капель на расстояние свыше 1–2 метров. Эффективность передачи зависит также от количества вируса, выделяемого инфицирующими животными, а также от длительности и близости контакта. Несмотря на то, что количество вируса при выделении может быть одинаковым, вирусы легче передаются от больных в острой фазе заболевания, а не вирусоносителями, так как их выделения, как правило, более обильные. Однако носители, несомненно, имеют большую значимость, особенно там, где имеют место тесные контакты, например в питомниках.
Вирус появляется в носовых и ротоглоточных секреторных выделениях уже через 24 часа после заражения и, как правило, активно выделяется в течение 18-30 дней. В случае латентного носительства, вирус способен реактивироваться под действием факторов, понижающих иммунитет (стресс, беременность, лактация, применение кортикостероидов, сопутствующее заболевание). Реактивация вируса происходит, в среднем, через 7-10 дней после, например, действия стресса, и период вирусовыделения продолжается от 3-4 дней до 2-х недель.
Лабораторная диагностика инфекционного ринотрахеита кошек
Безусловно, в литературе описано значительное количество методов диагностики герпесвирусной инфекции кошек, но, в данной статье, хотелось бы остановиться на методах, имеющих на наш взгляд наибольшее практическое значение.
Выделение вируса на культуре клеток
В 1958 году Crandell and Maurer продемонстрировали, что вирус FHV-1 растет и вызывает цитопатический эффект в культуре клеток почки кошки, что позволило создать in vitro систему для выделения и изучения свойств FHV-1.
Для выделения вируса FHV-1, берут мазок с поверхности конъюнктивы или слизистой оболочки ротоглотки, обычно используют стерильные тампоны из хлопка или дакрона. Сразу после взятия пробы тампон помещают в пробирку с 1-1,5 мл с вирусной транспортной среды с антибиотиками. При необходимости, пробы замораживают и сохраняют при – 70о С. Для выделения вируса обычно используют культуру клеток почки кошки CrFK, выращенную на плашках (Рис 8. Культура клеток CrFK).
Зараженную культуру клеток инкубируют в течение 10 дней, просматривая каждые 24-48 часов, для обнаружения признаков цитопатического действия FHV-1 (герпесвируса кошек). (Рис 9 а, б. а – Цитопатическое действие вируса на культуру клеток CrFK через 48 часов после заражения; б – через 72 часа после заражения).
Для подтверждения и идентификации выделенного изолята вируса FHV-1 используют метод иммунофлуоресценции, а также электронную микроскопию.
Основными недостатками метода выделения вируса на культурах клеток являются:
- Длительность (до 10 дней), высокая трудоемкость, сложность и дороговизна данного метода.
- Невозможность выделения вируса в случае бактериальной контаминации взятых образцов.
Вероятно, что незрелый, не обладающий достаточной инфекционностью вирус, продуцируемый на некоторых стадиях FHV-1 инфекции, ограничивает чувствительность традиционного метода выделения вируса. В дополнение к этому, разрушение оболочек вирионов при транспортировке, связывание вируса антителами (образование комплекса вирус-антитело) на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек, также в некоторых случаях являются возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Важным этапом в совершенствовании методов диагностики инфекционных заболеваний явилась разработка методов, позволяющих обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Создание принципиально нового способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые возможности для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.
Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мюллисом. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является специфичным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидных пар, называемые также праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n — число циклов амплификации. Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации (состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и построения фрагмента). В результате 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагментов, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном гелях. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.
Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.
Метод ПЦР превосходит метод выделения вируса на культурах клеток, особенно в случае бактериальной контаминации, которая мешает традиционной технике культивирования, более чувствителен и менее трудоемок.
Наличие вторичной бактериальной и грибковой инфекции может осложнять и маскировать первичную вирусную инфекцию, затрудняя клиническую диагностику. Таким образом, существенным является возможность определения вирусных протеинов или вирусной ДНК для подтверждения диагноза первичной вирусной инфекции. ПЦР может являться одним из методов подтверждения FHV-1 инфекции в гистологических образцах в подозрительных случаях
К сожалению, диагностика FHV-1 инфекции с помощью ПЦР амплификации, имеет ограниченную клиническую ценность, поскольку могут выявляться латентные инфекции, широко распространенные у кошек, таким образом, невозможно будет определить, играет ли FHV-1 первичную роль в возникновении заболевания, или же он просто реактивировался из латентного состояния под действием стресса или сопутствующей инфекции. Немалую роль в ограничении использования ПЦР является дороговизна оборудования, высокая требовательность к качеству реактивов и их высокая стоимость, строжайшие требования к помещениям и организации работы в ПЦР-лаборатории для исключения контаминации образцов продуктами амплификации.
Реакция иммунофлуоресценции
Реакцию иммунофлуоресценции, была предложена предложенную Кунсом в 1942 году, и ее трудно отнести к новым методам исследования. Однако, эта реакция получила в настоящее время "вторую жизнь" благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела. Их применение позволило значительно увеличить ее чувствительность и специфичность.
Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой РИФ, сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе (антивидовыми). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.
Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.
Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для обнаружения антител. В ветеринарной вирусологии РИФ активно используется для диагностики следующих вирусных заболеваний:
- вирус бешенства (непрямая РИФ),
- вирус иммунодефицита КРС (непрямая РИФ),
- коронавирус собак (непрямая РИФ),
- чума собак (непрямая РИФ),
- инфекционный перитонит (коронавирус) кошек (прямая РИФ),
- респираторный и репродуктивный синдром свиней (прямая РИФ).
Для диагностики FHV-1 используют как прямую, так и непрямую РИФ.
Для обнаружения FHV-1 обычно берут эпителиальные клетки конъюнктивы (конъюнктивальную полость перед взятием пробы очищают от слизи и гнойных выделений), скарифицирую их под местной анестезией. При необходимости, скарифицируют и эпителиальные клетки роговицы. Скарифицированные клетки помещают на предметное стекло, высушивают при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне в течение 10 минут.
РИФ является чрезвычайно ценным методом при диагностике FHV-1. Метод иммунофлуоресценции можно по праву отнести к экспресс-методам диагностики, поскольку он позволяет получить результат в течение 1-1,5 часов с момента взятия образца на анализ, прост в исполнении, не требует стерильной работы (Рис 10 а, б. а – свечение клеток культуры CrFK, инфицированных вирусом FHV-1; б – свечение разрушенных вирусом FHV-1 клеточных мембран (мазок от больной кошки).
Гистохимический вариант ИФА или иммунопероксидазная реакция
Иммунопероксидазная реакция аналогична методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, и учет реакции проводят не под люминесцентным, а под обычным световым микроскопом. Обычно, в этом варианте ИФА используют антитела, меченные пероксидазой. Материалом для выявления вирусспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазной реакции могут служить: мазки-отпечатки различных органов, парафиновые срезы, культура клеток, мазки крови. Аналогично РИФ, иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах.
Иммунопероксидазная реакция в прямом и непрямом вариантах используется для выявления вирусов бешенства, ящура, герпесвирусов, энтеровирусов. В исследованиях на FHV-1, иммунопероксидазная реакция используется, главным образом для определения вирусного антигена в образцах тканей при гистологических исследованиях (Рис 11. Гистохимия мазка отпечатка с конъюнктивы больной кошки. Локализация антигенов вируса FHV-1 видна в виде коричневых пятен/точек на белом фоне).
Иммуноферментный анализ
ИФА – специфичный и универсальный метод, отличающийся высокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов. В ИФА первый известный компонент (антитело или антиген) сорбируют на твердую фазу. Следующие компоненты, включая исследуемые пробы, вносят последовательно в жидком растворенном виде. Сформировавшиеся после инкубации иммунные комплексы антиген-антитело отделяют от непрореагировавших компонентов реакции при отмывании планшет. В ИФА используют противовирусные или антивидовые антитела, меченные пероксидазой хрена (ПХ) или другими ферментами, которые затем выявляются различными субстратами. Изменение цвета регистрируется визуально или спектрофотометрически, что дает возможность проводить количественный учет результатов анализа (Рис 12. Постановка непрямого твердофазного ИФА).
Разработаны различные варианты ИФА: прямые, непрямые, методы блокирования и конкурентные. В прямых вариантах используются меченые ферментом противовирусные антитела, в непрямых – антивидовые конъюгаты. В конкурентном варианте и методе блокирования, типирование и титрование исследуемых антигенов и антител обеспечивается за счет вытеснения с их помощью определенного количества меченого антигена или антитела.
Для обнаружения антител к FHV-1, ИФА ставят на многолуночных микротитровальных плашках, сенсибилизированных антигеном FHV-1 по стандартной методике; используют как моноклональные антитела, так и поликлональные анти-кошачьи IgG, в качестве ферментной метки чаще всего используют пероксидазу хрена (HRP). Для обнаружения FHV-1 антигена в ИФА, плашки сенсибилизируют анти-FHV-1 антителами, также меченными ферментом пероксидазой.
Определения показателя абсорбции проводят на автоматическом ИФА-ридере с фильтром 492 нм.
ИФА – универсальный, и на сегодняшний день наиболее чувствительный и совершенный метод определения антител к FHV-1 у кошек. Он позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной, спинномозговой жидкостях и даже в молоке, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин против FHV-1 и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета (что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания) и т.д. и т.п. Данный метод также чрезвычайно удобен для выявления вирусного антигена в смывах и соскобах со слизистой оболочки глаз, ротовой и носовой полостей.
Заключение
Герпесвирусная инфекция, по своей значимости, занимает одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний кошек. Быстрый и точный диагноз является одним из важнейших факторов лечения и профилактики инфекционного ринотрахеита кошек. Применение методов иммунофлуоресценции, иммуногистохимии и иммуноферментного анализа для диагностики FHV-1, открывает новые перспективы в изучении и контроле этого серьезного заболевания.
Статья опубликована 18.07.2025
НАЧАЛО: ГЕРПЕСВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ КОШЕК. Часть 1.