Предлагаю Вам ознакомиться с работой коллектива ученых под руководством Emanuele Licata, посвященной исследованию влияния различных протоколов размораживания бластоцист на их выживаемость и реэкспансию.
Итак, криоконсервация ооцитов и эмбрионов является неотъемлемой частью лечения пациентов, проходящих вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). Её широкое применение позволило повысить безопасность и эффективность циклов сохранения фертильности и стимуляции яичников при ЭКО (увеличив кумулятивный показатель живорождения и снизив частоту многоплодных беременностей и риск развития синдрома гиперстимуляции яичников). Более того, она позволила десинхронизировать гормональную стимуляцию, вызванную переносом эмбриона (ПЭ), что позволяет выбрать оптимальное время для ПЭ с точки зрения восприимчивости эндометрия и уровня гормонов у пациентки. Более того, это позволило применять инвазивные и неинвазивные методы отбора эмбрионов. В связи с этим в Европе растёт доля криоконсервированных циклов ПЭ по сравнению с циклами со свежими эмбрионами. В настоящее время витрификация является оптимальной стратегией для криоконсервации всех стадий развития: от зрелых ооцитов до эмбрионов на стадии бластоцисты.
Витрификация — это сверхбыстрый процесс замораживания, включающий дегидратацию ооцитов и использование высококонцентрированного криопротектора для предотвращения образования межклеточных и внутриклеточных кристаллов льда во время охлаждения, что приводит к стеклообразному затвердеванию (без кристаллов льда). Действительно, различные метаанализы и исследования показали, что витрификация/ нагревание превосходит медленное замораживание/размораживание с точки зрения клинических результатов и показателей криовыживаемости ооцитов, эмбрионов на стадии дробления и бластоцист.
После публикации протокола витрификации, описанного Куваямой, несколько авторов внесли изменения к процедуре с точки зрения как типа, так и концентрации криопротекторов, носителей, используемых в протоколе витрификации, как открытых устройств (Cryoleaf, Cryoloop, Cryotip, Vitrifit, Cryolock), так и закрытых устройств витрификации (HSV, cryopette), и размораживания, а также вариаций протокола, таких как витрификация ооцитов с кумулюсом и без него или витрификация эмбрионов с искусственным коллапсированием с помощью хэтчинга.
Учитывая, что витрификация является стандартной процедурой криотерапии и что спрос на неё постоянно растёт, научному сообществу следует сосредоточить внимание на максимизации её эффективности. Размораживание, следующее за витрификацией, является ключевым этапом в достижении результата лечения, и его скорость, по-видимому, оказывает существенное влияние на выживаемость размороженных и регидратированных эмбрионов. Учитывая это, снижение скорости нагревания может улучшить протокол с точки зрения успешности и практичности. Более того, поскольку эта процедура изначально сложная и трудоёмкая, её упрощение может не только повысить вероятность успеха, но и значительно улучшить физическую подготовку оператора, выполняющего её.
Хотя традиционная трёхэтапная техника нагревания более успешна, чем медленное размораживание, она, по-видимому, вызывает трудности на этапе после размораживания. Техника зависит от уровня квалификации оператора, и зачастую обучение ей требует значительного времени.
Другая существенная сложность процедуры заключается в соблюдении строгих временных рамок выполнения.
Влияние процедуры нагревания на жизнеспособность витрифицированных эмбрионов было тщательно изучено на нескольких моделях животных с целью проверки безопасности и достоверности различных методов. Например, замораживание и размораживание эмбрионов яка исследовалось с использованием одноэтапного протокола, включающей как нагревающую среду (1,08 М сахарозы), так и замораживающую среду (EFS40). Этот одноэтапный протокол привел к повышению выживаемости эмбрионов по сравнению с традиционным методом.
Эффект сокращения времени регидратации был отмечен и описан в предварительных исследованиях на человеческих ооцитах и бластоцистах. Некоторые авторы изменили время различных этапов в исходных протоколах витрификации и/или размораживания, успешно зафиксировав обнадеживающие результаты.
В ретроспективном анализе 754 криоконсервированных эмбрионов исходный протокол витрификации (выдержка в уравновешивающем растворе (ES) в течение 6–10 мин, затем в растворе для витрификации (VS) в течение 30–60 с.) сравнивали с двумя вариантами: (1) традиционная витрификация с быстрым размораживанием (размораживающий раствор (TS), 1 мин при 37 °C перед помещением эмбрионов в культуру) и (2) сокращенное воздействие ES с быстрым размораживанием (ES в течение 2 мин, затем 30–60 с воздействием VS).
В исследовании, проведённом Тейлором, в общей сложности 200 бластоцист были случайным образом разморожены с использованием стандартного протокола (1 мин TS; 4 мин DS; 8 мин промывки раствором WS; и перенос в питательную среду) или сверхбыстрого протокола (1 мин TS и перенос в питательную среду). Данные не выявили значимых различий между протоколами с точки зрения частоты имплантации и наступления беременности.
Кроме того, Либерманн предложил одноэтапный протокол для человеческих эмбрионов, исключив этап DS, используя только этап TS при 37 °C в течение 1 минуты, после чего эмбрионы были перемещены непосредственно в питательную среду. В этом ретроспективном когортном исследовании сравнивались 833 эмбриона FET (одноэтапный протокол регидратации) с 2606 эмбрионами FET (стандартный многоэтапный протокол регидратации) в качестве контрольной группы. Результаты не выявили значимых различий между двумя группами по уровню выживаемости и частоте наступления клинической беременности. Более того, в одноэтапном протоколе FET наблюдалось увеличение частоты продолжающейся беременности, имплантации и выкидышей.
Целью данного проведенного исследования была оценка валидности и безопасности одноэтапного протокола размораживания на эмбрионах человека, витрифицированных на стадии бластоцисты. В этом модифицированном протоколе на этапе нагревания использовали DS (0,5 M сахарозы, 37 °C — 3 мин), избегая предыдущего этапа (TS, 1 M сахарозы, 37 °C — 1 мин), а затем эмбрионы переносили непосредственно в питательную среду для оценки их повторного расширения и выживаемости.
В одноэтапном протоколе эмбрионы погружали непосредственно в 500 мкл DS при 37 °C на 3 минуты, а затем переносили в отдельные лунки чашки GPS, содержащей предварительно уравновешенный CSCM-NXC, чтобы обеспечить повторное расширение. Эмбрионы были классифицированы, и фотографии были сделаны сразу после нагревания и через 2 часа после нагревания для оценки выживаемости эмбрионов. Все процедуры витрификации и размораживания для каждого протокола проводились с использованием устройств Cryolock, содержащих по одному эмбриону на устройство. Статистический анализ выживаемости эмбрионов после нагревания проводился с использованием критерия χ2 (данные выражены в процентах; значение p считалось статистически значимым при 0,05).
Полученные авторами данные не выявили значительной разницы в выживаемости через 2 часа после размораживания между стандартным протоколом и упрощенным одноэтапным протоколом (98% против 94%; p-значение = 0,3), а также какой-либо разницы в количестве эмбрионов, которые были полностью реэкспандированны, вылупились или вылупились при оценке через 2 часа после нагревания (84% против 80%; p-значение = 0,6). Одноэтапное размораживание витрифицированных бластоцист в 0,5 М сахарозе не показало отрицательного воздействия на реэкспансию эмбрионов и их выживаемость после размораживания по сравнению со стандартным протоколом.
В недавней литературе некоторые предварительные исследования, проведённые на ооцитах и бластоцистах, о которых также сообщал Либерманн, указывают на то, что сокращение времени регидратации этого биологического материала может привести к отличной выживаемости. Однако слишком быстрый процесс нагревания может привести к повреждению клеток, что ставит под угрозу выживаемость биологического материала, например, к разрыву блестящей оболочки. В этом исследовании используется только фаза DS (0,5 М сахарозы), нагретая до 37 °C; это позволяет эмбрионам восстановить равновесие более постепенно и менее интенсивно по сравнению с тем, что происходит во время фазы TS (1 М сахарозы).
В этом исследовании авторы сообщили, что показатели выживаемости бластоцист при использовании разбавленного одношагового протокола были такими же, как и при использовании стандартного метода витрификации/нагревания.
Этап TS считается наиболее сложным по нескольким причинам: (1) необходимость сокращения времени экспозиции (максимум 60 с) биологического материала из-за высокой концентрации молярного сахара; (2) необходимость изменения фокусировки микроскопа для отслеживания движения биологического материала, который, отделяясь от устройства, движется к апикальной поверхности капли. Во время этапа TS всплывание биологического материала к поверхности капли TS может затруднить его извлечение в течение ожидаемого времени, не превышающего 60 с, что приводит к его непреднамеренному повреждению.
Вместо этого, используя только этап DS, биологический материал отделяется от поверхности устройства и оседает на дно капли, что облегчает его обнаружение в течение 3 минут.
К настоящему времени немногочисленные исследования, изучавшие возможные эффекты модификации различных этапов стандартного протокола витрификации/ размораживания, дали обнадеживающие результаты. Этот протокол предлагает исключить первый этап (TS; 37 °C; 1 мин) стандартной процедуры размораживания, что упрощает и сокращает время, необходимое для её проведения. Фактически, погружение эмбрионов в менее плотный раствор облегчает извлечение биологического материала. Позволяют менее опытным эмбриологам выполнять размораживание эмбрионов и получать более высокий уровень выживаемости по сравнению с выполнением других протоколов, требующих этапа TS (стандартные и/или одноэтапные протоколы).
В заключение следует отметить, что эти результаты свидетельствуют о том, что витрифицированные бластоцисты способны выдерживать прямое нагревание 0,5 М сахарозе при температуре 37 °C, аналогично нагреванию при обычной витрификации.
Показатели выживаемости и повторного расширения бластоцист, прошедших протокол одноэтапного размораживания с разбавлением, сопоставимы со стандартным протоколом размораживания; кроме того, простота, безопасность и скорость протокола одноэтапного разбавления делают его потенциально превосходной альтернативой стандартному, особенно если это связано с процессом обучения и выполнения самой техники.
Однако результаты этой работы требуют подтверждения исследованиями, направленными на изучение частоты имплантации и наступления беременности.
Эти обнадеживающие результаты, безусловно, требуют проведения клинических исследований, которые могли бы подтвердить эффективность, безопасность и различные преимущества метода для лабораторного персонала