Метод Леффлера

Метод Леффлера (Löffler’s methylene blue stain) - это гистологический метод окраски, используемый для визуализации бактерий, особенно Corynebacterium diphtheriae (возбудителя дифтерии), в мазках из зева или носа. Он также может использоваться для окрашивания других бактерий и некоторых клеточных структур. Метод разработан немецким бактериологом Фридрихом Леффлером.

Принцип метода:

Метод Леффлера основан на использовании щелочного раствора метиленового синего. Метиленовый синий - это катионный краситель, который связывается с отрицательно заряженными компонентами клеток, такими как ДНК, РНК и некоторые белки. Щелочная среда усиливает связывание красителя с бактериальными клетками.

Реактивы:

• Раствор метиленового синего Леффлера:Метиленовый синий: 0,3 г
  95% этиловый спирт: 30 мл
  Раствор гидроксида калия (KOH) 1%: 1 мл
  Дистиллированная вода: 100 мл
  Приготовление раствора:Растворите метиленовый синий в 95% этиловом спирте.
  Добавьте раствор гидроксида калия.
  Добавьте дистиллированную воду.
  Тщательно перемешайте.
  Отфильтруйте раствор перед использованием.
  

Процедура окраски:

1. Приготовление мазка:Нанесите тонкий слой исследуемого материала (например, мазок из зева) на чистое, обезжиренное предметное стекло.
   Дайте мазку высохнуть на воздухе.
   Зафиксируйте мазок нагреванием на пламени горелки (быстро проведите стекло над пламенем несколько раз) или с помощью химического фиксатора (например, 95% этилового спирта).
   
2. Окраска:Поместите предметное стекло с мазком на горизонтальную поверхность.
   Залейте мазок раствором метиленового синего Леффлера на 1-3 минуты (время окраски зависит от конкретной задачи и может варьироваться).
   
3. Промывка:Слейте краситель и промойте мазок дистиллированной водой.
   
4. Высушивание:Дайте мазку высохнуть на воздухе или аккуратно высушите фильтровальной бумагой.
   
5. Микроскопия:Рассмотрите мазок под микроскопом с использованием иммерсионного масла (обычно при увеличении ×1000).
   

Результаты:

• Бактерии: Окрашиваются в синий цвет. При дифтерии хорошо видны характерные палочки Corynebacterium diphtheriae, часто расположенные в виде частокола (латинской буквы V или Y) и содержащие метахроматические гранулы (гранулы Воллютина), которые окрашиваются более интенсивно.
• Клетки человека: Окрашиваются в различные оттенки синего.
• Ядра клеток: Окрашиваются более интенсивно, чем цитоплазма.

Применение:

• Диагностика дифтерии: Метод Леффлера является простым и быстрым способом выявления Corynebacterium diphtheriae в мазках из зева или носа.
• Обнаружение других бактерий: Метод можно использовать для окрашивания других бактерий, но он не является специфичным.
• Изучение морфологии бактерий: Метод позволяет изучить форму, размер и расположение бактерий.
• В учебных целях: Метод часто используется в учебных лабораториях для обучения студентов основам микроскопии и окраски бактерий.

Преимущества метода Леффлера:

• Простота выполнения.
• Низкая стоимость реагентов.
• Быстрота получения результатов.

Недостатки метода Леффлера:

• Не является специфичным для Corynebacterium diphtheriae.
• Не позволяет определить вид бактерий.
• Не позволяет оценить количество бактерий.

Важно:

Метод Леффлера является вспомогательным методом диагностики дифтерии. Для подтверждения диагноза необходимо проводить бактериологическое исследование с выделением чистой культуры возбудителя и определением его токсигенности.