Вашему вниманию представляется обзор, посвященный тонкостям и нюансам процедуры интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), подготовленный специалистами "The Ronald O. Perelman and Claudia Cohen Center for Reproductive Medicine", New York, USA. В обзоре особое внимание уделяется ключевой роли андрологической лаборатории в оценке и лечении бесплодных пациентов, подчеркиваются критически важные этапы подготовки к процедуре ИКСИ и основные факторы, необходимые для ее успешного проведения, включая выбор идеального сперматозоида, нарушение зрелости ооцитов, надлежащее оборудование и, что наиболее важно, выполнение самой процедуры.
Когда ВРТ стали более доступными, сразу же стало понятно, что пары с незначительным или выраженным мужским фактором бесплодия часто не удается осуществить первый этап in vitro, известный как оплодотворение. Проблема была в первую очередь выявлена в нарушении параметров спермы, что привело к упрощенному решению, заключающемуся в содействии взаимодействию двух гамет для преодоления препятствия, представленного zona pellucida. Для достижения этого подхода были предложены различные методы. Один из методов включал осеменение ооцитов суспензией сперматозоидов с более высокой концентрацией в микрокаплях среды, в то время как другой подход включал истончение блестящей оболочки с помощью ферментов. Кроме того, были предложены такие методы, как создание отверстия в оболочке путем подачи кислого раствора Тироде через микропипетку или создание надреза в толще оболочки с помощью острой микроиглы. Эти методы в лучшем случае имели незначительный эффект, поскольку, хотя они и способствовали взаимодействию сперматозоидов с оолеммой, они часто приводили к полиспермии из-за чрезмерного количества сперматозоидов, достигающих оолеммы.
Было признано, что реальная проблема неудачного оплодотворения была связана не только с параметрами мужских гамет, но и с внутренней дисфункцией сперматозоида, связанной с его способностью сливаться с оолеммой. Это плохо изученное в то время явление позднее было приписано недоразвитой или отсутствующей акросоме. Тем не менее, практика
микроинъекции сперматозоидов субзонально была общепринятым методом лечения мужского бесплодия, пока в Брюсселе не произошло одно счастливое событие.
В этом случае пионер д-р Gianpiero D. Palermo модифицировал субзональную инъекцию и вместо инъекции 15–20 сперматозоидов в положение 6 или 12 часов решил вводить только 3 сперматозоида в положение 3 часа, предварительно вызвав акросомную реакцию. Такой подход, одновременно с непреднамеренным нарушением оолеммы, позволил одному сперматозоиду проникнуть в ооплазму. Это «событие» было в некоторой степени повторяющимся и сопровождалось на удивление постоянным оплодотворением, что побудило доктора Джанпьеро Палермо усовершенствовать процедуру и разработать процесс, известный сегодня как метод ИКСИ.
Действительно, ИКСИ имеет то преимущество, что гарантирует оплодотворение независимо от характеристик спермы или источника образца и позволяет мужчинам даже с самыми плохими параметрами спермы иметь шанс на зачатие. Этот вариант также распространяется на мужчин с азооспермией, у которых гаметы, полученные непосредственно из мужских половых путей, будь то придаток яичка или яичко, могут быть использованы для инъекции ооцитов.
В настоящее время процедура ИКСИ проводится во всех лабораториях ВРТ по всему миру благодаря ее стабильным результатам оплодотворения и широко применяется даже в некоторых парах без явных показаний к мужскому фактору. Основываясь на полученном опыте и особой архитектуре лаборатории, авторы обзора подчеркивают детали, которые способствовали широкой популярности ИКСИ, которая распространилась даже на случаи, не связанные с мужским фактором.
Дефицит активации ооцитов, связанный с ооплазмой.
Протоколы овариальной суперовуляции в циклах ЭКО хорошо известны и устоялись. В эпоху гонадотропинов зрелость ооцитов была в некоторой степени предсказуема на основе морфологии кумулюсных комплексов. Однако при введении аналогов ГнРГ/гонадотропинов наблюдалась диссинхрония между комплексом ооцит-кумулюс и зрелостью ядра ооцита. Последующее внедрение протоколов с антагонистами ГнРГ выявило еще одну потерю взаимосвязи, на этот раз между ядерной и цитоплазматической зрелостью ооцита. Это явление повлияло на частоту оплодотворения при ИКСИ, особенно в подгруппе пациентов, у которых, несмотря на достаточное количество ооцитов и, по-видимому, нормальные параметры спермы, наблюдалась неожиданная и редкая полная неудача оплодотворения.
Эта характеристика была тонкой и непостоянно присутствует в разных циклах ВРТ, даже у одного и того же пациента. Такая диссинхрония между ядерной и цитоплазматической зрелостью остается практически незамеченной при стандартном осеменении in vitro, что допускает наличие клеток кумулюса-короны, способствующих задержке завершения цитоплазматической зрелости. Кроме того, одновременное присутствие сперматозоидов в течение ночи облегчает оплодотворение, как только ооциты достигают готовности. Хотя ИКСИ позволяет оценить зрелость ядра и обеспечивает беспрепятственный обзор во время инъекции, она может задержать или остановить процесс созревания цитоплазмы, что приведет к внедрению сперматозоида в то время, когда ооплазма еще не готова.
Таким образом, хотя ИКСИ позволяет добиться оплодотворения независимо от аномалий спермы, все равно может произойти полная неудача оплодотворения, чаще всего из-за недостаточной активации ооцитов. Чтобы определить дефицит активации ооцитов, необходимо учитывать, что это явление связано с отсутствием или дисфункцией цитозольного лабильного белка сперматозоидов, который в настоящее время идентифицируется как фосфолипаза-Cζ (PLCζ), присутствующего в перинуклеарной теке сперматозоида. Однако совсем недавно было признано, что неудача оплодотворения может быть обусловлена плохой восприимчивостью ооплазмы. Действительно, проводили исследование, влияет ли время созревания in vivo и in vitro влияет на нарушение зрелости ооплазмы путем сравнения циклов ИКСИ с полной неудачей оплодотворения с циклами с успешным оплодотворением у тех же пациентов. Были измерены основные временные интервалы: от триггера хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) до извлечения ооцитов (hCH-OR), которое определяет созревание in vivo, от извлечения ооцитов до удаления кумулюсных клеток (OR-CCR) и от удаления кумулюсных клеток до инъекции спермы (CR-ICSI). Два последних интервала определяют созревание in vitro.
В исследовании приняли участие 15 пациенток, и было обнаружено, что циклы с полной неудачей оплодотворения имели значительно более короткие интервалы между hCH-OR и OR-CCR. Эти результаты свидетельствуют о том, что созревание ядра, о чем свидетельствует выталкивание первого полярного тельца, не всегда совпадает со зрелостью цитоплазмы, которая сама по себе имеет решающее значение для успешного оплодотворения. Простое увеличение этих временных интервалов, особенно hCH-OR, а также OR-CCR, улучшило показатели оплодотворения в последующих циклах. Это также предполагает, что комплекс кумулюса играет важную роль в сигнальных путях, необходимых для завершения созревания цитоплазмы, даже если выступы оолеммы удалены. Оптимизация сроков проведения ключевых процедур может стать простым, но эффективным способом улучшения результатов ВРТ.
В более позднем исследовании эти же результаты были подтверждены. Действительно, относительные цитоплазматические нарушения созревания были выявлены у пар (n=52), где ооциты не оплодотворялись даже при инъекции сперматозоидов, в которых, как оказалось, содержалось достаточное количество PLCζ. Эти пары также выиграли от изменения протокола суперовуляции путем увеличения времени созревания in vivo и in vitro, что помогло увеличить частоту оплодотворения с 2,1% до впечатляющих 59,0%.
Выбор идеального сперматозоида.
Стандартный анализ спермы включает такие оценки, как период воздержания, объем и вязкость, а также оценку концентрации, морфологии, подвижности и жизнеспособности. Во время спермиогенеза гистоны в ДНК сперматозоидов заменяются протаминами, что позволяет ДНК скручиваться в компактные тороидальные структуры. Это уплотнение облегчает движение гамет и защищает отцовский геном во время его прохождения через агрессивную среду женских половых путей. Примечательно, что 16–20% ДНК остается связанной с гистоном в линкерных областях, которые более подвержены повреждениям. Эту восприимчивость невозможно обнаружить с помощью стандартного анализа спермы. В последнее время внимание сосредоточено на гетерогенном геномном составе мужской гаметы, известном как фрагментация хроматина сперматозоидов (SCF). Исследования показали, что у пожилых мужчин, как правило, наблюдаются более высокие уровни SCF по сравнению с их молодыми коллегами. Более того, существует положительная корреляция между днями воздержания и увеличением SCF. Повышенные уровни могут быть вызваны внешними факторами, такими как токсины окружающей среды, курение, диета или частое использование джакузи, а также внутренними факторами мужского полового тракта, такими как окислительный стресс или дефектное созревание половых клеток.
Было высказано предположение, что в нормальных физиологических условиях во время спермиогенеза в семенных канальцах процесс суперспирализации вокруг протаминового ядра обязательно включает разрезание и исправление ДНК. Любые потенциальные ошибки обычно выявляются и фагоцитируются в придатке яичка. Однако нарушение этого процесса может привести к попаданию сперматозоидов с поврежденной ДНК в эякулят. Присутствие SCF влияет на исход беременности при естественном зачатии, внутриматочной инсеминации (ВМИ) и экстракорпоральном оплодотворении, хотя его эффект менее выражен при ИКСИ. Это можно объяснить уменьшением воздействия активных форм кислорода на ооциты во время этой процедуры. Более того, выбор наиболее подвижных сперматозоидов, вероятно, обеспечивает более здоровый геном, способствуя лучшим результатам. Несмотря на это, неисправленные повреждения ДНК остаются значимой причиной выкидыша, даже при ИКСИ.
Хотя мы знакомы с концепцией анеуплоидии ооцитов человека, мы гораздо меньше осведомлены о хромосомной анеуплоидии мужской гаметы. Это связано с тем, что исторически было установлено, что вклад анеуплоидии мужских гамет в зачатие составляет в лучшем случае 5%. Однако исследования показали, что гоносомная анеуплоидия довольно часто встречается у многих мужчин с бесплодием или субфертильностью, о чем свидетельствует оценка методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с акцентом на конкретные вовлеченные хромосомы. Совсем недавно этот вопрос был пересмотрен с использованием и оценкой сперматозоидов, полученных хирургическим путем, где было выявлено, что хромосомные аномалии достигают 20%. Осознание этого факта вызвало обеспокоенность относительно ИКСИ и использования сперматозоидов, полученных хирургическим путем непосредственно из мужских половых путей. Однако знание о более высокой анеуплоидии хирургически полученных сперматозоидов позднее были подвергнуты сомнению путем оценки еще большего количества хромосом с помощью FISH и одновременного кариотипирования всей хромосомы с помощью секвенирования следующего поколения (NGS), что сделало анеуплоидию хирургически полученных сперматозоидов сопоставимой с эякулированным аналогом.
Установлено, что у некоторых популяций бесплодных мужчин повышен риск передачи анеуплоидии от мужской гаметы эмбриону. К ним относятся мужчины с реципрокными или робертсоновскими транслокациями и синдромом Клайнфельтера. Удивительно, но хромосомные аномалии сперматозоидов de novo могут возникать даже у мужчин с нормальным кариотипом, как это наблюдается в случаях пожилого возраста отца, тяжелой олигоастенотератозооспермии, глобозооспермии, необструктивной азооспермии и всех других форм мужского бесплодия, связанных с анеуплоидией сперматозоидов. Кроме того, актуальность оценки анеуплоидии сперматозоидов проявилась в случаях повторных выкидышей. Действительно, рецидивирующая анеуплоидия эмбриона, такая как трисомия 21, может возникать у пар с молодой партнершей и, по-видимому, связана с анеуплоидией мужской гаметы, а не ооцита. В этих конкретных случаях оценка анеуплоидии сперматозоидов методом FISH и более тщательно методом NGS является актуально для оценки вклада мужской гаметы в развитие зародыша.
Проксимальная центриоль человеческого сперматозоида играет решающую роль в организации сперматозоида, отвечая за правильное разделение родительских хромосом при первом митотическом делении. Аберрантные центросомы связаны со сложной и порой хаотической анеуплоидией, что приводит к аномальному развитию эмбриона. После оплодотворения правильная функция центросомы также важна для развития аппарата биполярного веретена во время деления клетки, а исследования с использованием визуализации показали, что аномалии веретена нарушают развитие эмбриона. Кроме того, центросома, особенно дистальная центриоль, хотя и не участвует в организации микротрубочек в оплодотворенной яйцеклетке, служит каркасом для сперматозоида и, если отсутствует или ненормально, способствует нарушению кинетики.
Оценка наличия центросомы сперматозоидов особенно полезна для пар с необъяснимым бесплодием, несмотря на нормальные параметры спермы и отрицательные результаты обследований на бесплодие. Его можно оценить с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, а также с помощью методов с большим увеличением, таких как просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Для изучения тонкого мужского фактора, который может нарушать репродуктивный потенциал, авторы обзора провели оценку центросомы у 12 пар, которые не смогли получить эуплоидные эмбрионы для переноса. У этих мужчин они обнаружили нарушенные структуры центриолярных структур сперматозоидов, на что указывало отсутствие центросомной флуоресценции, в 54,1±5% исследованных клеток. Кроме того, ТЭМ подтвердила, что приблизительно у 50% сперматозоидов наблюдались нерегулярные и/или неполные проксимальные центриоли, характеризующиеся отсутствием одного или нескольких плеч микротрубочковых триплетов или хаотичным расположением. Чтобы понять связь между генетическим профилем сперматозоидов и причинами репродуктивной недостаточности после ИКСИ, у 31 пары с отрицательными результатами обследований на бесплодие и нормальными параметрами спермы авторы провели секвенирование ДНК генома сперматозоидов и выявили мутации в ключевых генах, участвующих в развитии и функционировании центросомы (HAUS1, MAP1S, SUPT5H, PLK4). Эти гены были не затронуты сперматозоиды лиц, которые служили контрольной группой и достигли беременности. Это говорит о том, что существуют обнаруживаемые генетические различия в сперматозоидах мужчин с необъяснимым бесплодием и что эти различия можно использовать для понимания конкретных аспектов их необъяснимых неблагоприятных результатов ВРТ.
Несмотря на доступные дополнительные тесты, которые можно использовать для оценки мужских гамет, причины плохих репродуктивных результатов, возникающие, несмотря на нормальный анализ спермы, связанные со спермой, остаются в значительной степени неизвестными. Это особенно актуально для бесплодных мужчин, у которых в прошлом были дети. Поэтому авторы предположили, что мутации de novo, приобретенные в течение жизни человека, играют роль в мужском бесплодии. Действительно, когда они оценили геном сперматозоидов с помощью NGS и стратифицировали результаты по возрасту отца, то наблюдали прогрессивное увеличение вариантов числа копий (CNV), а также тенденцию к снижению показателей клинической беременности с увеличением возраста отца. Кроме того, наша оценка сперматозоидов бесплодных мужчин выявила значительно более высокую заболеваемость ХНВ (8,6%) по сравнению с фертильной группой (4,0%). Сперматозоиды из бесплодной группы также несли различные генные мутации, которые были распространены среди мужчин, проходивших лечение в различных вспомогательных репродуктивных технологий, что позволяет предположить, что оценка генома мужской гаметы может потенциально дать информацию о наиболее эффективном методе лечения. Для изучения этой концепции авторы провели полное экзомное секвенирование ДНК сперматозоидов, чтобы изучить связь между генетическим профилем сперматозоидов и причинами репродуктивной недостаточности после ИКСИ у пар с отрицательными результатами обследований на бесплодие и нормальными параметрами спермы. В сперматозоидах всех мужчин были обнаружены мутации генов, связанных со слиянием сперматозоида и яйцеклетки (ADAM3A) и акросомальным развитием (SPACA1, SPATA16), независимо от клинического результата. Наличие этих мутаций у всех мужчин из исследуемой популяции подтверждает, что ИКСИ является оптимальной вспомогательной репродуктивной технологией, поскольку дефекты слияния сперматозоида и яйцеклетки и развития акросомы ухудшают оплодотворяющую способность сперматозоидов, которую можно преодолеть только с помощью ИКСИ, а не с помощью ВМИ или стандартного ЭКО. Когда авторы разделили пары на подгруппы в соответствии с причинами неудачных циклов ИКСИ, то обнаружили, что у тех, у кого оплодотворение было слабым или отсутствовало, имелись дополнительные мутации в генах, необходимых для связывания сперматозоида с яйцеклеткой (ADAM15) и активации ооцита (PLCZ1).
Генетическая оценка спермы у пар, не получивших нормальные оплодотворенные яйцеклетки ПГТ-А, выявила мутации в генах, отвечающих за целостность центросомы (HAUS1) и стабилизацию веретена/микротрубочек (KIF4A, XRN1). У пар с неудачной имплантацией сперматозоиды несли мутации в генах, в первую очередь участвующих в поддержании целостности микротрубочек и/или центросомы (MAP1S, SUPT5H, PLK4), а также в рецепторе интерлейкина (IL9R) , который участвует в эмбриональной имплантации. Наконец, генетическая оценка спермы пар, у которых беременность прервалась на 7–8 неделе после имплантации, выявила мутации в генах, связанных с развитием трофобласта (NLRP7), регуляцией клеточного цикла (MARK4, TRIP13, POLD1, DAB2IP, KIF1C), а также ген, связанный с привычным выкидышем (TP53). Интересно, что эти мутации генов-кандидатов были уникальны для каждой подгруппы и также не были обнаружены в фертильной когорте. Таким образом, скрининг на наличие мутаций зародышевой линии может стать полезным инструментом точной медицины для улучшения диагностики, лечения и прогнозирования клинических результатов, особенно для пар с необъяснимым бесплодием.
Дефицит ооцитов, связанный со спермой
Оплодотворение начинается, когда сперматозоид проникает в блестящую оболочку ооцита и сливается с оолеммой. Во время ИКСИ эти биологические барьеры обходят, и один сперматозоид вводится непосредственно в ооцит. Независимо от метода оплодотворения, PLCζ, лабильный белок массой около 74 кДа, хранящийся в перинуклеарной теке, высвобождается в ооплазму, вызывая возобновление мейоза ооцита и активацию ооцита . Редкие случаи полного неудачного оплодотворения, например, при глобозооспермии, которая редко возникает после ИКСИ, может быть связана с потерей или отсутствием PLCζ или неспособностью ооцита должным образом реагировать на связанный со спермой активирующий фактор.
Оборудование для ИКСИ.
ИКСИ — очень чувствительная процедура, на успех которой могут повлиять даже незначительные изменения окружающей среды. Станция оплодотворения должна располагаться в помещении со стабилизированным климатом и комфортной температурой окружающей среды, поскольку ИКСИ проводится вне инкубатора, и поэтому точный контроль температуры имеет решающее значение. Чашка для ИКСИ относительно неглубокая, и открытая ч аша м ожет быстро терять температуру.Поэтому на станции микроманипуляции следует избегать прямой верхней вентиляции. Для ИКСИ желательно иметь постоянную температуру около 34 °C в центре нагревательной ступени, что немного ниже 36 °C, необходимых для полимеризации веретена человеческого ооцита. Учитывая все эти факторы, правильный нагревательный этап, в идеале система, способная равномерно нагревать блюдо со всех сторон, имеет решающее значение для поддержания стабильной тепловой среды во время микроманипуляций. Хотя более низкие температуры приемлемы, исследования показали, что воздействие высоких температур на ооциты также может вызвать спонтанную активацию ооцитов. Кроме того, предпочтительнее приглушенное освещение, чтобы избежать чрезмерного воздействия света на гаметы и чтобы оператор имел лучший обзор через микроскоп. Микроманипуляционные столы оснащены антивибрационной системой, которая эффективно противодействует любым движениям, гарантируя отсутствие помех во время процесса инъекции. Это важно, поскольку ИКСИ проводится на инвертированном микроскопе при увеличении ×100, и любая вибрация имеет огромное значение. Эта особенность особенно важна в лабораториях, расположенных в высотных зданиях. Еще одним ключевым компонентом, обеспечивающим бесперебойное проведение ИКСИ, являются микропипетки. Пипетки для удерживания и инъекции изготовлены из боросиликатного стекла с толстым стержнем, обеспечивающим эффективное проникновение в блестящую оболочку и оолемму. Обе пипетки согнуты под углом примерно 30° на расстоянии 1 мм от кончика для манипулирования гаметами, при этом кончик инструмента должен находиться в горизонтальном положении в пластиковой чашке для ИКСИ. Некоторые операторы предпочитают использовать инъекционные пипетки большего диаметра, поскольку они более жесткие и менее склонны к изгибу. Больший диаметр особенно выгоден для образцов, содержащих значительное количество мусора, например, для образцов, извлеченных хирургическим путем.
Инъекционная среда.
ИКСИ проводится вне инкубатора; Поэтому инъекционные среды предназначены для использования в окружающем воздухе, а pH поддерживается с помощью HEPES. Чтобы избежать длительного воздействия HEPES, рекомендуется быстро провести ИКСИ, чтобы ограничить повреждение ооцитов. В случаях, когда извлекается большое количество ооцитов, оператору следует рассмотреть возможность введения ооцитов небольшими партиями. Проведение ИКСИ подразумевает разрыв оолеммы, а то, как ведет себя мембрана во время инъекции, и появление воронки гарантируют целостность ооцита. На реакцию оолеммы на проникающую инъекционную пипетку могут влиять несколько факторов, такие как зрелость ооцита или характеристики мембраны, и они могут существенно повлиять на развитие будущего эмбриона. Хотя разработка и внедрение ИКСИ были относительно сложными, после разработки четкого рабочего протокола процедура становится относительно простой, по крайней мере до появления сред, предназначенных для длительного культивирования на стадии бластоцисты. Это включало переход к использованию сред с пониженным содержанием пирувата, изменение содержания глюкозы и постепенную замену белка на незаменимые и заменимые аминокислоты. В частности, снижение содержания белка было неблагоприятным для ИКСИ из-за измененного поведения оолеммы во время процедуры. В то время как поведение оолеммы в основном объясняется реакцией ооцита на суперовуляцию яичников, ооциты, содержащиеся в среде с недостаточным содержанием белка, часто демонстрируют липкую мембрану, которая имеет тенденцию прилипать к пипетке ИКСИ, изменяя форму инъекционной воронки, когда пипетку извлекают из ооцита. Неполное закрытие оолеммы может привести к нарушению тонуса цитоскелета и образованию зиготы 3PN, тогда как случаи с отсутствующей или перевернутой воронкой могут привести к лизису ооцита. Эти проблемы часто можно решить, внимательно наблюдая за поведением оолеммы и впоследствии корректируя концентрацию белка в среде ИКСИ.
Иммобилизация сперматозоидов.
Хотя ИКСИ обычно не требует специальной предварительной обработки сперматозоидов, агрессивная иммобилизация посредством механического давления имеет решающее значение. Этот метод подразумевает прокатывание хвостика сперматозоида по дну чашки для ИКСИ, как правило, позади средней части, чтобы вызвать постоянный перегиб. Это способствует индукции капацитации — естественного физиологического процесса, происходящего в женских половых путях. Капацитация включает в себя ряд изменений в сперматозоиде, включая модификации мембранных липидов, изменения в мембранных белках, таких как бета-дефензины и липокалин, а также корректировки внутриклеточной концентрации ионов кальция, все из которых подготавливают сперматозоид к успешному оплодотворению. Кроме того, агрессивная иммобилизация проницает как плазматическую мембрану, так и внешнюю акросомальную мембрану, вызывая мгновенную акросомную реакцию, что позволяет высвободить предполагаемый цитозольный фактор спермы PLCζ в ооцит. Следует отметить, что колеблющееся количество белка в среде инкубации спермы, если его недостаточно, не позволяет оператору правильно иммобилизовать сперматозоид, что ухудшает проницаемость плазматической мембраны и внешней акросомальной мембраны, необходимая для успешного оплодотворения. Агрессивная иммобилизация особенно важна для сперматозоидов, извлеченных хирургическим путем из яичка или придатка яичка, поскольку у них отсутствуют мембранные белки, обычно секретируемые эпителием придатка яичка, что приводит к менее зрелым характеристикам мембраны по сравнению со спермой, полученной в результате эякуляции. Это несоответствие влияет на процесс капацитации, необходимый для оплодотворения, что очевидно в стандартных процедурах экстракорпорального оплодотворения, где наблюдаются сниженные возможности связывания и проникновения при использовании эпидидимальных сперматозоидов. Интересно, что применение таких агрессивных методов иммобилизации к сперматозоидам, извлеченным хирургическим путем, приводящее к более обширному разрушению хвостика сперматозоида, было связано со значительным улучшением показателей оплодотворения. В некоторых случаях эти показатели даже превосходили показатели, достигнутые при использовании эякулированных сперматозоидов.
Подробности инъекции.
Ооцит надежно удерживается на месте за счет отсасывания, осуществляемого через удерживающую пипетку. Чтобы свести к минимуму риск повреждения, инъекционную пипетку затупляют, постукивая ее кончиком по краю удерживающей пипетки перед прокалыванием ооцита. Расположение полярного тельца ооцита по направлению к верхней части чашки Петри улучшает визуализацию во время процедуры инъекции. Это важно, поскольку митотические веретена обычно располагаются под полярным тельцем, и правильное расположение помогает избежать повреждения этих критически важных структур. Затем опускают инъекционную пипетку и регулируют ее уровень так, чтобы она была направлена на внешний правый профиль оолеммы на экваториальной плоскости в положении «3 часа». Такое расположение обеспечивает более контролируемую и эффективную инъекцию, поскольку обеспечивает полный диаметр ооцита, предоставляя больше места для растяжения и разрыва мембраны. Сперматозоид продвигается к кончику инъекционной пипетки.
Затем пипетку вводят в блестящую оболочку, проникая в ее толщу и достигая оолеммы, после чего в оолемме создается инвагинация. Когда пипетка достигает приблизительно центра ооцита, происходит разрыв мембраны, о чем свидетельствует внезапное дрожание и поток цитоплазматических органелл и сперматозоидов, движущихся вверх в пипетку. Затем сперматозоид медленно выбрасывается вперед в ооплазму, после чего следует небольшое всасывание цитоплазмы, что обеспечивает дополнительный активирующий стимул, который заставляет ооцит возобновить мейоз. Для оптимального взаимодействия с ооплазмой сперматозоид следует выбросить за кончик пипетки, за пределы центра ооцита, в треть ооцита, ближайшую к положению «9 часов». Это гарантирует, что сперматозоид будет расположен глубоко среди ооплазматических органелл, которые удерживают сперму на месте, пока пипетка извлекается.
При извлечении пипетки излишки среды аспирируются, в результате чего цитоплазматические органеллы сжимаются вокруг сперматозоида и запечатывают нарушение, образовавшееся во время инъекции. В течение всей инъекции фокус должен оставаться на положении ооцита на 3 часах и кончике пипетки. После извлечения пипетки осматривают область разрыва, чтобы убедиться, что она сохраняет форму воронки с запечатанной вершиной, направленной к центру ооцита.
Если оолемма не разрывается во время инъекции, можно предпринять несколько шагов для облегчения процесса. В положении «9 часов» осторожно сделайте размашистое движение, чтобы способствовать разрыву. Если мембрана по-прежнему не разрывается, медленно отведите пипетку к краю ооцита, соответствующему 3 часам, и повторно введите ее выше места первоначальной инъекции, зацепив край пипетки за верхний край воронки, чтобы осторожно растянуть мембрану по направлению к 9 часам и способствовать ее разрыву. Чтобы еще больше облегчить разрушение мембраны, осторожно перемещайте пипетку вдоль оси Z с помощью винта Z , создавая движение вверх-вниз. Это должно помочь достичь необходимого разрыва в оолемме. Важно не затягивать процесс инъекции в ооцит, поскольку чем больше времени требуется для проникновения через мембрану, тем тверже и устойчивее она становится, становясь клейкой и все более затрудняя успешную инъекцию. Техника инъекции зависит от морфологических характеристик ооцита. Некоторые ооциты могут представлять трудности, требующие изменения стандартного метода инъекции, описанного выше, с учетом специфических характеристик каждого ооцита. Например, ооциты с большим перивителлиновым пространством могут быть трудно поддаются инъекции, поскольку они имеют тенденцию смещаться во время проникновения инъекционной пипетки в зону. Это затрудняет проникновение в оолемму в экваториальной плоскости. Чтобы обойти эти проблемы, определите сторону ооцита, где оолемма расположена ближе к блестящей оболочке или почти касается ее. Использование удерживающей пипетки для отсасывания в этой области позволит лучше стабилизировать ооцит. Затем проникните в zona pellucida, убедившись, что ооцит находится в положении «3 часа», а кончик удерживающей пипетки находится внутри перивителлинового пространства. Сосредоточьте внимание на этих двух областях во время введения в ооцит.
Приведенные выше примеры являются типичными ситуациями, когда необходимо скорректировать технику инъекцийв соответствии с характеристиками женской гаметы, направленными на получение успешного оплодотворения.
Заключение.
За последние три десятилетия авторы обзора осуществили инъекции огромного количества ооцитов, что позволило накопить значительный опыт и успешно справляться с широким спектром сценариев. Целью данной обзора является не только поделиться опытом, но и важными нюансами, способствующими оптимальному успеху ИКСИ. Тщательное внимание к деталям, обсуждаемое на протяжении всего исследования, подчеркивает важность точности и опыта для достижения надежных результатов удобрения и преодоления различных проблем, связанных с оплодотворением. Поразительная эффективность ИКСИ привела к тому, что ее применение вышло за рамки традиционных случаев мужского бесплодия, продемонстрировав ее универсальность и преобразующее влияние на ВРТ.
Важно понимать, что успех программы ИКСИ выходит за рамки навыков оператора ИКСИ. Это требует, чтобы весь центр репродуктивной медицины был нацелен на оптимальное выполнение этой методики. Это предполагает четкую координацию между клиникой, андрологической лабораторией и эмбриологической лабораторией. Клиника играет решающую роль в получении высококачественных гамет и постоянном взаимодействии с лабораториями, которые предоставляют обратную связь о качестве полученных ооцитов. Андрологическая лаборатория играет важную роль в определении лучших тестов для скрининга генома, эпигенома и протеома с целью выбора идеального сперматозоида. Эмбриологическая лаборатория тесно сотрудничает с оператором ИКСИ, обеспечивая обратную связь и взаимодействие посредством покадровой оценки концепций. Действительно, лаборатория PGT-A, которая оценивает генетику эмбрионов, также играет решающую роль, отдавая предпочтение ИКСИ в качестве основного метода оплодотворения из-за его способности минимизировать риск заражения нецелевой спермой и повышать точность генетических оценок. Благодаря таким скоординированным усилиям каждый этап процесса оптимизируется, что в конечном итоге способствует повышению показателей успеха.