Исследование проводили на микроскопном стенде для измерения Рамановских спектров, замораживание препарата происходило в прокачиваемом азотном криостате. Эмбрионы помещались в раствор глицерина в воде, начальная концентрация которого варьировала от 20 до 60 % v/v в зависимости от эксперимента. Протокол охлаждения состоял из нескольких этапов. Первый этап заключался в предварительном охлаждении до температуры +18 °C. Далее препарат охлаждали со скоростью 1 °C/мин до температуры, при которой происходит образование льда (–12 ÷ -30 °C). Затем проводили медленное охлаждение (0.3 °C/мин) до температуры –35 °C. По достижении заданной температуры проводилась имитация погружения образца в жидкий азот путем охлаждения препарата на максимально возможной скорости (40 °C/мин) до температуры –120 °C. Наблюдение за эмбрионами и измерение спектров проводилось в перерывах между этапами охлаждения при постоянной температуре. В ходе измерений были получены Рамановские спектры от замораживаемых эмбрионов и их окружения. Рамановская спектроскопия позволяет проводить in situ измерения различных концентраций криопротекторов в ходе замораживания препарата. Измерения показали, что на промежуточных этапах концентрация глицерина в разных точках препарата одинакова. Однако, после скоростного охлаждения до –120 °C в спектрах наблюдаются различия. Из этих данных следует, что локальная концентрация глицерина в образце может отличаться на величину порядка 10%. Анализ спектров окружения не выявил особенностей в составе раствора в непосредственной близости (~10 мкм) от эмбрионов.
(с) Евгений Юрьевич Брусенцев