В 2019 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрило препарат Trikafta для пациентов с муковисцидозом (МВ), имеющих наиболее распространенную мутацию, вызывающую заболевание. Трикафта нацелена на дефектный белок - неправильную форму трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), который образуется в результате этой мутации.
Однако люди с другими мутациями в гене CFTR, в том числе с вариантами, при которых белок вообще не вырабатывается, не могут воспользоваться этим препаратом. «Поэтому интерес проявляется к генной терапии», - говорит Дэниел Зигварт, химик из Юго-Западного медицинского центра Техасского университета.
Современные методы генной терапии предполагают доставку инструментов для редактирования генов, исправляющих мутации, непосредственно в клетки легких. Однако такие средства часто вводятся путем вдыхания и с трудом преодолевают густую, липкую слизь на пути к клеткам.
Теперь в статье, опубликованной в журнале Science, Зигварт и его команда показали, что липидные наночастицы (LNP), вводимые внутривенно, успешно доставляют инструменты для редактирования генов во все типы клеток легких, включая стволовые клетки.
Этот подход позволил надолго исправить гены в мышиной модели МВ и в клетках пациентов. Система на основе LNP предлагает новые терапевтические возможности для доставки инструментов редактирования генов в конкретные ткани.
Зигварт и его команда хотели оценить систему доставки, которая бы достигала клеток легких и не оказывала бы внецелевого воздействия. Для этого они использовали ранее описанную стратегию, названную ими селективным нацеливанием на органы (SORT), в которой используются модифицированные ЛНП (SORT LNPs), несущие механизмы редактирования на основе кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR).
Регулируя концентрацию дополнительной молекулы, Зигварт и его команда могут направить ЛНП и их генетический груз в селезенку, печень или легкие. В данном исследовании ученые поставили перед собой задачу выяснить, какие типы клеток в легком получают ценный генетический груз ЛНП.
Исследователи внутривенно вводили нацеленные на легкие ЛНП SORT здоровым мышам, сконструированным таким образом, чтобы экспрессировать красный флуоресцентный белок в любой клетке, подвергшейся редактированию генов. Когда команда Зигварта выделила легочную ткань из обработанных мышей и рассмотрела ее под микроскопом, они увидели клетки, равномерно светящиеся красным цветом, что свидетельствовало о широком распространении редактирования генов. Через 22 месяца они заметили, что клетки все еще светятся красным, что подчеркивает долговечность системы доставки.
Чтобы понять, какие типы клеток подверглись длительному редактированию, они выделили клетки легких и провели проточную цитометрию. Они выявили множество типов клеток, включая эпителиальные клетки, иммунные клетки и стволовые клетки. Эти эксперименты показали, что редактирование генов сохранялось в 45-80 процентах стволовых клеток.
Хотя способность LNP получать доступ к стволовым клеткам не удивила Зигварта, он не ожидал, что редактирование генов продлится так долго. «Я чуть со стула не упал», - сказал он. Устойчивое редактирование открывает возможности для однократного лечения, пояснил он.
Хотя они знали, что их система нацелена на легкие, они не знали, как именно она этого добивается. Зигварт и его команда ранее показали, что ЛНП SORT после введения в организм связываются с белками плазмы, что помогает им достичь клеток-мишеней.Five Чтобы изучить, как эти ЛНП попадают в легкие, исследователи изучили белки, покрывающие поверхность ЛНП после их введения. Они обнаружили, что частица была обогащена белком под названием витронектин, рецептор которого присутствует в нескольких типах клеток легких.
Вооружившись эффективной системой доставки, Зигварт и его команда решили проверить ее терапевтический потенциал при генетических заболеваниях. Для этого они использовали линию мышей, несущих мутацию в гене CFTR. Внутривенные инъекции SORT LNPs, несущих генный редактор, нацеленный на эту мутацию, привели к ее исправлению почти в половине клеток легких.
Чтобы протестировать систему на человеке, исследователи использовали клетки легких, выделенные от пациента с МВ, который несет мутацию гена CFTR, устойчивую к существующим методам лечения малыми молекулами, и культивировали эти клетки в условиях, имитирующих биологию дыхательных путей человека.
Обработка этих клеток ЛНП, содержащими CRISPR-редактор, нацеленный на мутацию CFTR, привела к ее исправлению с очень небольшим количеством нецелевых правок, что было оценено с помощью секвенирования ДНК. Чтобы проверить, перешло ли это исправление на уровень белка, исследователи провели иммуноблотинг и химические анализы, которые выявили восстановление уровня и функции CFTR.
«Цель доставки наночастиц только к одному типу клеток в организме - это несбыточная мечта», - говорит Зигварт. Он считает, что вместо этого исследователи должны сосредоточиться на максимальном обогащении клеток-мишеней, одновременно изучая возможность доставки в другие типы клеток. Зигварт и его команда разработали свою систему таким образом, чтобы накопление LNP в тканях, не являющихся мишенью, было минимальным, добавил он.
«Это очень интересно», - говорит Гаурав Сахай (Gaurav Sahay), ученый по доставке лекарств из Университета штата Орегон. По его словам, способность LNPs доставлять механизмы редактирования генов в стволовые клетки легких является значительным прорывом в этой области. «Следующий шаг в этом исследовании - показать, что это можно сделать на более высоком животном, например, нечеловеческом примате, и безопасно доставлять генные редакторы внутривенно», - сказал он.
«Мы готовы сотрудничать с другими исследователями, которые разработали модели МВ у разных видов», - сказал Зигварт. Хотя он надеется, что LNP в конечном итоге дойдут до клинических испытаний, он говорит, что на это может потребоваться время.
«Мы еще далеки от того, чтобы это стало клинической реальностью, - сказал он. Но если это удастся перенести на людей, то это может позволить излечиться на всю жизнь