Родился в 1495 году в дворянской семье графов Тулузских. В 21 год юноша подался в монашеский орден рыцарей-госпитальеров и перебазировался на остров Родос. В 1522 году он активно участвовал в обороне Родоса от турок, а после падения острова вместе с уцелевшими рыцарями после 8 лет скитаний по Европе переместился на Мальту. Там Ла Валетт подобно другим мальтийским рыцарям занялся пиратством, участвовал в набегах на берберийское побережье. В 1534 году де ла Валетт командовал галерой, а в 1540 году у него был собственный галиот. В 1541 году попал в плен к туркам, на протяжении года был галерным рабом, был освобожден благодаря обмену пленными. С 1546 по 1549 год был губернатором Триполи.
21 августа 1557 де ла Валетт стал великим магистром Мальтийского ордена, которого многие европейские и мусульманские государства признали суверенным правителем Мальты. В 1565 году Турция снарядила против Мальты эскадру с 35-тысячным войском. К моменту подхода противника на острове было примерно 540 рыцарей с оруженосцами, а также примерно 1000 испанских пехотинцев и аркебузиров и около 4000 мальтийцев в ополчении. Де ла Валетт возглавил оборону и отразил нападение противника.
Турецкий флот подошёл к Мальте 18 мая 1565 года. В течение трёх месяцев, несмотря на численное превосходство и силу артиллерии османов, все турецкие атаки были безуспешны.
7 сентября к рыцарям прибыла помощь от испанского вице-короля Сицилии — 9 тысяч человек. После этого турки сняли осаду и отплыли с Мальты. С острова вернулась лишь четверть турецкой армии. У христиан погибло 250 рыцарей, практически все выжившие были ранены или искалечены. Историки называют такие цифры потерь: от 3 до 6 тысяч — защитники острова, от 20 до 40 тысяч — турки. От городов Биргу и Сенглеа не осталось камня на камне, новый город был заложен в другом месте.
Победа принесла ордену огромный престиж и возродила его славу как защитника христианского мира от мусульманской экспансии.
После смерти рыцаря и пирата Жана де Ла Валетта в 1568 году отстроенную им заново столицу Мальты назвали в его честь.