3DISCO - в переводе с английского обозначает « 3D визуализация органов, очищенных растворителем» — это гистологический метод, который делает биологические образцы более прозрачными (так называемыми «очищенными») за счет использования ряда органических растворителей для согласования показателя преломления (RI) тканей с окружающей средой.
Структуры в прозрачных тканях можно исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии без необходимости выполнения трудоемких физических срезов и последующего компьютерного моделирования.
Метод был разработан командой Али Эртюрка и Ганса-Ульриха Додта в Институте Макса Планка в Мюнхене и был направлен в первую очередь на очистку и визуализацию несекционированных образцов головного и спинного мозга мышей. Позже оригинальный метод или его модифицированные версии были успешно использованы во многих областях биологических исследований для визуализации и исследования всего тела мышей, структуры и функций мозга мыши,стволовых клеток,опухолевые ткани, процессы развития, или целые человеческие эмбрионы.
Протокол 3DISCO включает три этапа :
- начальная дегидратация, выполняемая тетрагидрофураном (ТГФ)
- экстракция липидов путем инкубации в дихлорметане (ДХМ)
- погружение в дибензиловый эфир (DBE) для согласования RI
Дегидратация, инкубация и визуализация в среде с RI уменьшают рассеяние света и приводят к получению прозрачного образца. Протокол 3DISCO лучше всего подходит для фиксированных тканей, помеченных сильными флуорофорами.
Весь процесс относительно прост в исполнении и требует только изменения заданных растворов без необходимости в каком-либо индивидуальном лабораторном оборудовании. Процесс очистки и последующей визуализации быстрый (от нескольких часов до дней в зависимости от размера образца), особенно по сравнению с физическим разрезом целого органа, визуализацией его частей и реконструкцией перед последующим анализом изображения (который может легко занять несколько недель). Кроме того, 3DISCO работает со многими типами тканей (легкие, селезенка, лимфатические узлы, молочная железа, опухоли).
Основными недостатками этого метода являются частичная делипидизация ткани во время очистки, что делает использование липофильных красителей недопустимым, усадка ткани во время очистки, частичная деградация флуоресценции, полная деградация флуоресценции при длительном хранении и токсичность используемых реагентов (и их потенциальная возможность повредить объективы микроскопа в случае утечки из камеры визуализации).
Разновидность протокола - iDISCO (immunolabeling-enabled imaging of solvent-cleared organs «иммуномаркированная визуализация очищенных растворителем органов») включает предварительную обработку образца метанолом, перекисью водорода, детергентами и диметилсульфоксидом вместе с маркировкой антителами перед очисткой.
Этот предварительный процесс устраняет два недостатка маркировки антителами больших образцов, таких как снижение аутофлуоресценции образцов и повышение отношения сигнал/шум и повышение проницаемости тканей для антител. В результате образцы размером с эмбрионы мышей или целые органы мышей могут быть успешно окрашены флуоресцентно мечеными антителами, а затем очищены и визуализированы.