Многие из нас эту аббревиатуру впервые услышали-увидели во времена коронавирусной пандемии, не к ночи она будь помянута. Между тем, этому методу молекулярной биологии уже более сорока лет. Изобрёл его биохимик Кэри Муллис, за что впоследствии получил Нобелевскую премию. Именно о ПЦР - полимеразной цепной реакции - я сегодня и расскажу.
Что такое ПЦР?
Это процесс, который позволяет в исследуемом биологическом образце отыскать-обнаружить фрагмент нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) конкретного вида, даже в том случае, если в этом образце искомой нуклеиновой кислоты ничтожно мало.
То есть ПЦР - это способ быстро отыскать биохимическую иголку в биохимическом стоге сена.
Зачем нужна ПЦР?
Биохимики и молекулярные биологи используют ПЦР в том случае, когда они точно знают, что именно ищут, и подозревают, что это находится в данном образце (в пробе крови, слюны, кусочке биологической ткани, в культуре клеток и т.д.).
Как выше уже было сказано, в розыске находится особый фрагмент ДНК или РНК (то есть нуклеиновая кислота с заранее известной последовательностью нуклеотидов, из которых она состоит).
Вот перечень ситуаций, когда бывает очень полезным и даже необходимым поискать конкретный фрагмент нуклеиновой кислоты:
🔬 определить заражён или нет человек вирусной/бактериальной/грибковой инфекцией;
🔬 определить заражено или нет животное вирусной/бактериальной/грибковой инфекцией;
🔬 определить заражено или нет растение вирусной/бактериальной/грибковой инфекцией;
🔬 установить/опровергнуть наличие родства между людьми (например, провести тест на отцовство);
🔬 установить/опровергнуть наличие генетической предрасположенности у человека к заболеванию;
🔬 обнаружить в генах человека мутации, которые могут влиять на эффективность лечения различных заболеваний (кроме того, некоторые мутации в генах могут служить маркерами онкологических заболеваний);
🔬 получить пригодный для дальнейших исследований генетический материал с места преступления;
🔬 проконтролировать применение генно-модифицированных организмов (ГМО), которые часто присутствуют в продуктах питания и различных кормах.
В чём суть ПЦР?
Говорят, чтобы найти иголку в стоге сена, нужно использовать магнит. Какой "магнит" используют при ПЦР для обнаружения искомой нуклеотидной цепочки? У этого "магнита" есть имя - амплификация. Похоже название на "репликацию"? И это неспроста. Репликация - копирование ДНК в естественных условиях, а амплификация - в искусственных, "по приказу" человека.
Для этого "подозреваемый" фрагмент ДНК/РНК из биопробы в специальной установке - амплификаторе - копируют много-много раз. Если в исследуемом образце было хотя бы небольшое количество искомых цепочек, то через несколько часов их там будут десятки и даже сотни миллионов. Бери и исследуй в волю! Теперь точно не промахнёшься с ответом - есть патоген в пробе или нет. Достоверность и точность метода почти 100%!
Что необходимо для ПЦР?
1️⃣ Амплификатор - прибор , в котором происходит амплификация - множественное копирование нуклеиновой кислоты.
2️⃣ Смесь нуклеотидов - строительный материал для копий ДНК-молекул (напоминаю, что молекулы ДНК и РНК построены из нуклеотидов).
3️⃣ ДНК-полимераза — белок-фермент, без которого невозможна ни репликация, ни амплификация нуклеиновых кислот.
4️⃣ Ионы магния (Mg2+) — они поддерживают активность ДНК-полимеразы.
5️⃣ Буферный раствор — смесь, которая создаёт оптимальные условия для биохимической реакции.
6️⃣ Два праймера — короткие нити из нуклеотидов, которые подходят к искомым нитям ДНК, как детали пазла. На основе праймеров в ходе ПЦР создаются новые ДНК-молекулы. Если праймеры не подошли, значит, искомой ДНК в биоматериале нет - стало быть, и копировать нечего.
Преимущества ПЦР
Помимо ПЦР есть ведь и другие способы выявить инфицирование. Например:
✅ иммуноферментный анализ - выявление и измерение количественного содержания антител в сыворотке крови. А уж выявленные антитела свидетельствуют о заражении инфекционным агентом, против которого они выработались, ведь на каждый антиген (вирус, например, или чуждый белок) - своё антитело;
✅ культуральное исследование - это посев-помещение биоматериала пациента в специальную среду для размножения микроорганизмов с целью дальнейшего их исследования и выявления патогенов.
Так вот, ПЦР самый эффективный из всех методов! Почему?
👍 Точность. 90-100% против 50-70% у иммуноферментного анализа и 60-80% у культурального исследования.
👍 Скорость. Результат ПЦР можно получить через один день против двух дней при иммуноферментном анализе и двух-трёх дней при культуральном исследовании.
👍 Независимость от особенностей патогена. Некоторые виды бактерий и прочих патогенов очень требовательны к условиям их выращивания, потому сложно или же вообще невозможно получить их колонии на искусственных питательных средах при культуральном исследовании. При ПЦР выращивать никого не требуется.
👍 Независимость от иммунной реакции и наличия симптомов. Если заражение произошло недавно, инфекция протекает в скрытой форме или у пациента есть иммунные нарушения, то антитела в его крови могут и не появиться, и тогда результат иммуноферментного анализа будет ложным. Мало того, у некоторых людей вообще не вырабатываются антитела против некоторых инфекций. А при ПЦР-анализе разыскивают не антитела, а самого вредителя. И найдут уже в первый день заражения.
Недостатки ПЦР
👎 Точечное применение. При ПЦР-исследовании лаборант заранее должен знать, что именно он ищет. Если при этом у пациента другая инфекция, то она обнаружена не будет.
👎 Очень высокая чувствительность к загрязнениям. Оборудование должно быть стерильным! Если загрязнится оно или проба биоматериала, то результат может оказаться ложным.