Статья подготовлена изданием Лаборант - журнал об аналитической химии. Подписывайтесь так же на наш телеграм-канал о научных новостях Клеточная биология.
Современные биологические тесты часто делятся на три основные категории: колориметрические, люминометрические и флуорометрические. В колориметрических тестах фиксируется количество света, поглощенного репортерным соединением, обычно представленное в виде оптической плотности (OD). Люминометрические тесты используют люминесцентные репортерные соединения, которые излучают свет, например, систему люцифераза / D-люциферин. Единицы измерения таких тестов - это относительные световые единицы (RLU). Флуорометрические тесты применяют репортеры, которые испускают свет при облучении вторичным источником света. Это излучение фиксируется в относительных флуоресцентных единицах (RFU).
Принцип флуоресценции заключается в том, что вещество поглощает энергию в виде фотонов, переходя в возбужденное состояние, и при возвращении в основное состояние выделяет эту энергию в виде излученного света. Из этого можно выделить несколько ключевых аспектов. Во-первых, вещества имеют распределение длин волн, при которых энергия поглощается. Это называется спектром возбуждения вещества, а наибольшая точка - его максимумом возбуждения, степень поглощения энергии - его коэффициентом экстинкции. Во-вторых, фотон, испускаемый флуоресцирующим веществом, содержит меньше энергии, чем поглощается, что приводит к излучению света с более длинной волной. Это различие между пиком возбуждения и пиком излучения называется сдвигом Стокса, а эффективность превращения поглощенной энергии в излученную называется квантовым выходом.
Одним из первых применений флуоресценции в биотестах был зеленый флуоресцентный белок (GFP), с пиками возбуждения / излучения на 475 нм / 510 нм, коэффициентом экстинкции / квантовым выходом 7000 М-1 см-1 / 0,79. С более чем миллионом публикаций, GFP исторически значим благодаря распространению 488 нм возбуждения как стандартного источника света для приборов, "зеленому" как наиболее часто регистрируемому излучению, и до сих пор популярен как репортерный ген для клеточных исследований. Успех GFP способствовал значительным достижениям в области флуоресцентного детектирования, особенно увеличению доступности синтетических флуоресцентных соединений, известных как флуорофоры, что позволило проводить биотесты от оценки жизнеспособности клеток до ПЦР.
Жизнеспособность клеток
Одним из самых распространенных оценок в биологических исследованиях является определение жизнеспособности клеток, то есть степени, до которой популяция клеток жива или мертва. Для этого давно установлены колориметрические тесты. Например, тесты исключения трипанового синего используются для подсчета популяций мертвых клеток. Это основано на принципе, что трипановый синий непроницаем для клеток и, следовательно, может окрашивать только мертвые клетки с нарушенными клеточными мембранами. Недостатком является то, что живые клетки остаются неокрашенными или прозрачными, что затрудняет их оценку. Возможное решение - использовать тест, который количественно оценивает популяции живых клеток. Опять же, существуют установленные колориметрические тесты, такие как MTT и CCK-8, которые выполняют эту функцию. Однако эти тесты создают обратную задачу, когда подсчитываются только жизнеспособные клетки, а нежизнеспособные - нет. Таким образом, колориметрические тесты хорошо установлены, но имеют свои ограничения. С другой стороны, флуорометрические технологии предлагают уникальное решение для этого применения, предлагая биотесты, которые одновременно количественно оценивают жизнеспособные и нежизнеспособные клетки.
Тесты на живые и мертвые клетки используют два флуорометрических реагента, например, кальцеин ам и йодид пропидия, для количественной оценки жизнеспособности клеток. Йодид пропидия, аналогично трипановому синему, непроницаем для клеток и исключается из живых клеток, поэтому действует как индикатор нежизнеспособности. Для обнаружения живых клеток используется кальцеин ам. Функциональная группа ам эфира на кальцеине увеличивает его гидрофобность, что позволяет ему проходить через клеточные мембраны, степень чего может быть дополнительно усилена детергентами, такими как Pluronic F-127. Важно отметить, что прохождение через клеточную мембрану само по себе не является показателем жизнеспособности, поскольку кальцеин ам также проникает в клетки с нарушенными мембранами. Здесь стоит отметить, что группа ам эфира выполняет еще одну функцию, делая молекулу кальцеина нефлуоресцентной. Только в живых клетках, где эстеразы повсеместны и активны, группа ам эфира отщепляется, что позволяет кальцеину флуоресцировать. Таким образом, кальцеин ам обнаруживает исключительно живые клетки, и в сочетании с йодидом пропидия позволяет тестам на живые и мертвые клетки одновременно оценивать жизнеспособные и нежизнеспособные клетки в одной популяции, тем самым демонстрируя одно из ключевых преимуществ флуорометрических тестов - возможность проведения многопараметрического анализа.
Клеточная визуализация
Одной из областей, где многопараметрический анализ особенно важен, является клеточная визуализация, где способность одновременно визуализировать различные клеточные компоненты предоставляет ключевые знания о внутриклеточных взаимодействиях и процессах. Среди этих компонентов в приоритете находится ядро, для которого разработано множество флуорофоров, например, акридиновый оранжевый и 7-AAD. Акридиновый оранжевый - это проницаемый для мембран краситель, который связывается с ДНК и РНК через интеркаляцию, тогда как 7-AAD связывается с нуклеиновыми кислотами по аналогичному принципу, но непроницаем для клеток. Преимущество использования любого из этих зондов заключается в том, что их спектры возбуждения / излучения схожи с GFP, что создает совместимость с уже существующими и широко распространенными флуоресцентными микроскопами и проточными цитометрами. Если требуется многопараметрический анализ, например, если зеленый флуоресцентный канал уже используется для детекции GFP, также доступны ДНК-зонды с синим флуоресценцией. Среди них популярны флуорофоры DAPI и Hoechst 33342.
Помимо флуоресцентной визуализации ядра, были разработаны реагенты для маркировки всех частей клетки. Например, фаллоидин, конъюгированный с флуорофором, может быть использован для визуализации актиновых филаментов, составляющих цитоскелет. Также разработаны красители для лизосом и митохондрий. Для последних, благодаря их значению в клеточном метаболизме и генерации АТФ, были разработаны флуоресцентные тесты, такие как JC-1, для оценки мембранного потенциала митохондрий. Для маркировки мембран в целом была успешна целая семья липофильных флуоресцентных красителей, а именно, красители DiD, DiI и DiR.
В то время как вышеупомянутые применения флуоресцентных технологий фокусируются на структурной маркировке клеток, существует также большое количество флуорофоров, которые позволяют проводить функциональные биотесты. Ключевыми среди них являются семейства кальциевых индикаторов, таких как Fluo-4 AM и Fluo-8 AM. Они позволяют исследователям изучать кальциевые реакции в клетках, что важно для скрининга и разработки лекарственных средств, основанных на GPCR, для лечения заболеваний. В том же духе, флуорофоры, такие как тиофлавин T, использовались в исследовании заболеваний для изучения накопления амилоидных фибрилл, которые являются ключевым маркером болезни Альцгеймера.
Обнаружение макромолекул
Как показано, флуоресцентные биотесты являются мощными инструментами для исследований на основе клеток. Частично это обусловлено широким выбором доступных флуорофоров и разнообразием целей, к которым они могут быть конъюгированы или химически маркированы. Например, маркирование белка аннексина V флуоресцеином дает аннексин V FITC, реагент, полезный для мониторинга апоптоза клеток через связывание с транслоцированной поверхностной фосфатидилсерином. В той же связи, конъюгация антител CD с фикобилипротеинами, такими как фикоэритрин и аллофикоцианин, оказалась чрезвычайно полезной как средство сортировки клеток по поверхностным маркерам.
Еще один важный класс биомолекул, который можно конъюгировать с флуорофорами, представляют собой олигонуклеотиды, которые представляют собой короткие последовательности нуклеиновых кислот. Эти, например, можно маркировать Cy3 или Cy5 для использования в флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), чтобы проводить пространственное обнаружение последовательностей специфических нуклеиновых кислот в клетках. В виде фосфорамидитов, 5-FAM и 6-FAM могут легко быть включены в синтез олигонуклеотидов, которые, при сочетании с подходящим гасителем, могут выступать в качестве молекулярного маяка, служа основой для проб TaqMan в анализе реального времени ПЦР. В рабочих процессах, использующих методы очистки нуклеиновых кислот, такие как захват мРНК с помощью магнитных бусин олиго(dT), флуоресценция может быть использована как инструмент для количественной оценки конечного выхода и оценки эффективности экстракции.
Хотя исследователям уже доступен значительный набор флуорометрических тестов, постоянно разрабатываются и совершенствуются новые методологии. Например, brdU давно используется для отслеживания пролиферации клеток путем мониторинга включения dNTP во время синтеза ДНК. Однако обнаружение в основном проводилось с использованием антител. Новые XdU тесты обходят зависимость от антител, маркируя dNTP непосредственно для флуоресцентной количественной оценки. Другие давно существующие тесты включают тесты количественной оценки белков, такие как тест BCA и тест Бредфорда, которые также были улучшены за счет замены на флуорометрические методы. По мере совершенствования химии флуоресценции и синтетических флуорофоров, без сомнения, будет доступно больше тестов, что позволит проводить более глубокие и проницательные исследования самых актуальных вопросов биологии.
Статья подготовлена изданием Лаборант - журнал об аналитической химии. Подписывайтесь так же на наш телеграм-канал о научных новостях Клеточная биология.