Статья подготовлена изданием Лаборант.
Подписывайтесь на наш телеграм-канал о научных новостях Молeкулярная диагностика.
Упрощение выбора для RNA-секвенирования: краткое руководство по различным методам
Вы решили исследовать транскриптом вашего объекта исследования и выбрали RNA-секвенирование (RNA-seq). Однако перед вами все еще стоит выбор из множества различных рабочих процессов.
Как определить, что выбрать?
Ответ зависит от вопросов, которые вы хотите решить, а также от происхождения, количества и качества ваших образцов. В этой статье мы кратко обсудим несколько рабочих процессов RNA-seq, их различия, преимущества и недостатки каждого из них.
Независимо от выбранного метода, каждый проект RNA-seq начинается с подготовки библиотеки – метода модификации РНК в вашем образце в молекулы, которые могут быть прочитаны инструментом для секвенирования. Хотя рабочие процессы подготовки библиотеки варьируются в зависимости от поставщика и платформы секвенирования, обсуждение ниже применимо к большинству из них.
Ваша основная цель – выявить или измерить экспрессию кодирующих белок генов?
Если так, и если ваши образцы из эукариотических организмов, методы захвата мРНК – ваш лучший выбор. Эти рабочие процессы сначала захватывают зрелые, полиаденилированные (поли-А) транскрипты с использованием субстрата, покрытого поли-Т олиго (обычно бусины или колонка), а затем продолжают подготовку библиотеки, используя только эти захваченные молекулы.
Метод захвата мРНК часто используется при сравнении профилей экспрессии различных образцов, таких как: опухолевая vs нормальная ткань, для поиска аномальных уровней экспрессии генов или для выявления ассоциированных с заболеванием транскриптов; клетки или организмы на разных стадиях развития, для выявления изменений в экспрессии генов; сравнение здоровых vs больных тканей или организмов для выявления стресс- или иммунно-опосредованной экспрессии генов; и в разработке лекарств, сравнение экспрессии генов в условиях лечения и без него.
Однако захват мРНК неэффективен с бактериальной или вирусной РНК (так как они обычно не имеют поли-А хвостов) и ненадежен с низкокачественными образцами; фрагментированная, деградированная РНК обычно не имеет полноразмерных полиаденилированных транскриптов, что может привести к искаженному или неполному результату.
Интересуют некодирующие и незрелые транскрипты? Или прокариотические образцы?
Если это описывает ваше исследование, выберите метод, использующий истощение рибосомной РНК для удаления обильно представленной рРНК из общего РНК образца. Поскольку рРНК может составлять 90-98% РНК в клетке и не имеет значения для большинства исследований, рибодеплеция снижает шум (потраченные впустую чтения) в конечных данных, что в конечном итоге экономит на затратах на секвенирование. Этот метод часто называют секвенированием всего транскриптома (WTS).
Некоторые преимущества рабочих процессов рибодеплеции: (1) они совместимы с прокариотическими образцами, хотя могут потребоваться пользовательские олиго для истощения для организмов, отличных от человека, мыши и крысы; (2) они позволяют секвенировать некодирующие и незрелые транскрипты, которые обычно не имеют поли-А хвостов; и (3) они эффективны с деградированными образцами. Кроме того, другие высоко представленные транскрипты также могут быть удалены с использованием комплементарных олиго, таких как транскрипты гемоглобина в образцах крови, что увеличивает процент информативных чтений секвенирования.
Хотите обнаружить конкретные транскрипты с большей точностью?
Иногда целью является измерение относительных уровней экспрессии определенной группы транскриптов – например, связанных с определенным типом или стадией рака. В таких случаях транскрипты интереса могут быть сконцентрированы с использованием методов обогащения целей; к ним относятся гибридизационные, методы на основе удлинения праймеров и ампликоны. Общий знаменатель для этих методов – использование специфических для последовательностей олиго, комплементарных транскриптам интереса, для захвата или амплификации этих транскриптов, в то время как остальные удаляются из конечной библиотеки секвенирования. Конечный результат – набор данных, обогащенный желаемыми последовательностями.
И список вариантов продолжает расти…
В дополнение к вышеуказанным методам, существуют также многие разные рабочие процессы для секвенирования РНК из отдельных клеток (scRNA-seq) и других ультранизковходных образцов. Многие мультиомные рабочие процессы комбинируют RNA-seq с секвенированием ДНК, анализом эпигеномов ДНК или РНК и/или анализом протеомов; однако даже в этих рабочих процессах важно выбрать правильный вариант RNA-seq. Все эти методы, когда используются в нужное время и в нужном месте, имеют огромный потенциал для продвижения фундаментальных исследований, а также для открытия и разработки лекарств.
*Существует множество различных инструментов и рабочих процессов для подготовки РНК к секвенированию, включая короткое и длинное чтение, секвенирование по синтезу, секвенирование по связыванию и нанопоровое секвенирование.
Статья подготовлена изданием Лаборант. Подписывайтесь на наш телеграм-канал о научных новостях Молeкулярная диагностика.