Оценка качества эмбрионов с помощью оптической визуализации становится все более популярной. Среди доступных оптических методов микроскопия с плоскостным освещением (Light Sheet Microscopy) стала превосходной альтернативой конфокальной микроскопии благодаря своей возможности быстрее получать изображения с меньшим фотоповреждением образца.
Современные методы оценки жизнеспособности эмбрионов, такие как визуальный осмотр для оценки предимплантационного развития или биопсия клеток для генетического тестирования, как известно, крайне субъективны и неточны. Неспособность точно предсказать жизнеспособность эмбрионов является ключевым фактором низкого уровня успешности клинического экстракорпорального оплодотворения. Поэтому существует потребность в точной и неинвазивной диагностике.
Оптическая визуализация становится все более распространенной в области биологии развития. Этот всплеск обусловлен в первую очередь ее врожденной способностью разгадывать сложные биологические процессы с высоким пространственно-временным разрешением. Исторически оптическая визуализация опиралась на использование экзогенных флуоресцентных меток для визуализации и количественной оценки определенных биологических явлений в клеточных структурах. Однако эти внешние флуоресцентные метки могут непреднамеренно нарушать лежащую в основе биологию клетки и создавать проблемы для точной интерпретации наблюдаемых клеточных изменений. В последнее время в этой области наблюдается сдвиг в сторону визуализации без меток, в частности, путем захвата клеточной аутофлуоресценции. Этот подход использует собственную флуоресценцию, испускаемую эндогенными молекулами, без необходимости в экзогенных метках.
Недавние исследования показали, что анализ изображений без меток может обнаруживать метаболические различия, которые коррелируют с жизнеспособностью эмбрионов. Это было выполнено с помощью однофотонной световой листовой микроскопии, эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
Конфокальная сканирующая микроскопия уже давно является золотым стандартом сбора клеточной автофлуоресценции. При использовании этого метода весь объем образца освещается каждый раз, когда формируется изображение z-плоскости. Такая схема освещения может привести к фотообесцвечиванию и фототоксичности. Тем не менее, конфокальная микроскопия продолжает широко использоваться для изучения процессов развития в различных типах клеток. Конфокальная микроскопия также использовалась для обнаружения динамических изменений метаболизма в живых ооцитах мыши и эмбрионах крупного рогатого скота. Однако неопределенность связана с безопасностью этого метода визуализации для живых эмбрионов.
В последнее время световая листовая микроскопия стала альтернативным и известным методом оптической визуализации для визуализации и оценки жизнеспособности эмбрионов. Для такой визуализации тонкий слой света возбуждает только флуоресценцию интересующей z-плоскости образца. Таким образом, этот метод позволяет быстро получить изображение. Этот подход потенциально снижает фотообесцвечивание по сравнению с методами эпифлуоресцентной визуализации, такими как конфокальная микроскопия.
Группа учёных из Австралии провели исследование, в котором они использовали ДНК в качестве индикатора фотоповреждения. Они применили микроскопию с плоскостным освещением для визуализации аутофлуоресценции эмбриона и сравнивали ее производительность с лазерной сканирующей конфокальной микроскопией. При эквивалентном соотношении сигнал/шум для изображений, полученных с помощью обоих методов, плоскостная микроскопия сократила время получения изображения в десять раз и не вызвала повреждения ДНК по сравнению с эмбрионами без визуализации.
Напротив, визуализация с помощью конфокальной микроскопии привела к значительно более высоким уровням повреждения ДНК внутри эмбрионов и имела более высокую скорость фотообесцвечивания. Визуализация светового листа также способна вызывать повреждение ДНК внутри эмбриона, но это требует нескольких циклов объемной визуализации.
В совокупности это исследование подтверждает, что микроскопия светового листа быстрее и безопаснее, чем конфокальная микроскопия, для визуализации живых эмбрионов, что указывает на ее потенциал в качестве диагностики без меток качества эмбрионов.
Кроме того, в отличие от конфокальной микроскопии, световая листовая микроскопия позволяет создать реконструкцию трехмерного изображения, которое отображает сигналы автофлуоресценции для всего объема эмбриона на стадии бластоцисты.
Эти результаты доказывают, что световая микроскопия является безопасным и эффективным оптическим подходом для визуализации эмбрионов, и подтверждают ее потенциал в качестве предпочтительного метода неинвазивной визуализации эмбрионов.