Биочипы – это матриксы элементов с биологическими зондами, закреплёнными на плоской поверхности. Каждая ячейка содержит уникальный зонд, содержащий свою собственную молекулу, распознающую ответную мишень в анализируемом образце.
Это революционное достижение биотехнологии последних лет. С помощью него можно за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ, и даже генетических дефектов. Биочипы позволяют обнаружить в организме животного маркеры, соответствующие конкретным заболеваниям, определённым вирусам и раковым клеткам, а также маркеры, отвечающие за определённые продуктивные признаки.
Первой в мире тест-системой на основе биочипов, зарегистрированной для медицинского применения, стал разработанный в ИМБ в 2004 г. набор «ТБ-Биочип-1». С его помощью можно определить наличие в геноме микобактерии туберкулеза 47 мутаций, приводящих к устойчивости к двум основным противотуберкулезным препаратам — рифампицину и изониазиду.
Почему внимание исследователей привлек именно туберкулез? Дело в том, что многие десятилетия для борьбы с этой болезнью использовали комбинированное лечение сразу несколькими химиопрепаратами, чтобы повысить его эффективность. При монотерапии больные быстро приобретали устойчивость к лекарству. Однако такая стратегия привела к тому, что уже в конце прошлого века в мире, в том числе и в России, начал повсеместно распространяться туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью. Именно этот фактор в наши дни чаще всего является причиной неудачного исхода лечения и возникновения рецидива болезни, от которой ежегодно в мире умирает более 3 млн человек.
Так в 2012–2013 гг. в результате масштабных геномных исследований был создан не имеющий мировых аналогов набор реагентов «ТБ-ТЕСТ», позволяющий одновременно идентифицировать 120 генетических локусов, отвечающих за развитие устойчивости к препаратам первой и второй «линии обороны»: рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным препаратам (амикацину и капреомицину) (Zimenkov et al., 2016). Такая диагностика позволяет дифференцированно назначать высокие дозы химиопрепаратов или, напротив, удалять те или иные лекарства из схем терапии.
Флуоресцентная картина при анализе ДНК возбудителя туберкулеза особо опасного генотипа Beijing B0/W148, устойчивого ко всем противотуберкулезным препаратам. Красные точки — ячейки, по которым проведена идентификация мутаций. На структуре биочипа системы «ТБ-ТЕСТ» (слева) разными цветами отмечены группы ячеек с иммобилизованными в них олигонуклеотидными зондами, специфичными к вариантам генов, связанных с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда.
Виды биочипов:
- ДНК-биочипы, используемые для идентификации генов и их мутаций, связанных с различными заболеваниями, диагностики инфекционных болезней, скрининга микроорганизмов;
- белковые чипы, которые используют для обнаружения белклвых маркеров, характерных для различных заболеваний на разных стадиях их развития;
- клеточные чипы, позволяющие избежать проблем нестабильности белков в белковых чипах и проводить более точный анализ взаимодействия белков внутри клетки, визуализация самой клетки и её органелл;
- тканевые чипы, позволяющие проводить анализ тысячи образцов тканей на одном предметном стекле и использующиеся для определения содержания белков в здоровых и патологически изменённых тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов;
- микрочипы на основе малых молекул, которые позволяют проводить одновременный скрининг тысяч потенциальных лекарственных средств;
- фикрофлюидальные чипы – многофункциональное устройство для обмена, между компонентами которого используюися электроды и микрожидкости.
Биочипы – матриксы элементов с биологическими зондами, закреплёнными на плоской поверхности. Каждая ячейка содержит уникальный зонд, содержащий свою собственную молекулу, распознающую ответную мишень в анализируемом образце.
В последнее время чаще используются именно гидрогелевые ячейки, так как у них больше преимуществ.
Объемные гидрогелевые 3D-ячейки биочипов имеют ряд преимуществ в сравнении с поверхностными. Например, в гидрогеле иммобилизованные молекулы-зонды, в том числе белки, сохраняют свою активность, а емкость наполнения ячейки зондами в десятки раз выше, чем в «плоских» биочипах.
Размещение молекулярных зондов в трехмерном объеме, а не на плоскости, дает ряд существенных преимуществ. Оно позволяет в десятки и сотни раз увеличить емкость биочипа на единицу поверхности и, соответственно, чувствительность измерений. Кроме того, гель — насыщенное водой желеобразное вещество, исключает возможность взаимодействия зондов друг с другом и с твердой поверхностью подложки, а также обеспечивает отличную изоляцию отдельных ячеек на биочипе.
Биочип включает подложку с нанесенным на нее полимерным рабочим слоем, образованным из сополимера на основе производных метакриловой кислоты с иммобилизованными на нем биологическими макромолекулами (зондами), причем подложка выполнена из активированного или неактивированного стекла, металла или полимерного материала с иммобилизованными на нем афинными биологическими зондами.
Для регистрации результатов анализа используют флуоресцентные метки, которые вводят в молекулы образца. Если зонд специфично распознает и свяжется с мишенью, в ячейке возникает флуоресценция. Интенсивность свечения ячеек биочипа измеряется с помощью специальных аппаратно-программных комплексов-анализаторов, которые и выдают отчет о присутствии в исследуемом образце специфичных молекулярных мишеней, информирующих о наличии микроорганизмов или генных мутаций, онкомаркеров или аллергенов и т. п.
Гидрогель, используемый в биочипах, обычно состоит из полимерных материалов с высоким содержанием воды. Одним из распространенных материалов является полиакриламидный гидрогель, который получают путем полимеризации акриламида. Этот гидрогель обладает способностью сорбировать и задерживать большое количество воды.
Состав мастермикса для проведения ПЦР (Состав реакционной смеси, нанесённой на подложку): Вода деионизованная MQ 19,5 мкл, ПЦР-буф 3,0 мкл, дНТФ 3,0 мкл, ПР-1 0,6 мкл, Taq 0,6 мкл, UNG 0,3 мкл
У разных мастермиксов может немного отличаться состав.
Преимущества биочипов
Широкое распространение биочиповых исследований связано с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, простотой выпол-нения процедуры, возможностью одновременного анализа множества парамет-ров и невысокой стоимостью. Технология микрочипов может использоваться как для исследовательских, так и для диагностических целей в разных областях науки и практики.
Проведение мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах позволяет охватить практически все области медицинской диагностики. Перспективным направлением развития белковых биочипов видится исследование маркеров воспалительных реакций для дифференциальной диагностики ревматологических, эндокринных заболеваний и других нарушений в работе иммунной системы.
Микрочипы также применяются для генотипирования в сельском хозяйстве и предоставляют селекционерам мощный инструмент для идентификации, проверки и скрининга генетических признаков растений и животных. Микрочипы содержат наборы ДНК-зондов (маркеров) из базы данных Axiom Genomic Database или маркеров de novo, в том числе созданных конкретным заказчиком.
Ограничения
Несмотря на достоинства ДНК-микрочипов, у них есть и ограничения в применении. Предполагается, что интенсивность сигнала (свечения), зарегистри-рованная в конкретном сайте микрочипа, линейно зависит от количества ДНК, которое прошло гибридизацию, что не всегда так: из-за кинетики гибридизации уровень сигнала, полученный в данной точке, не является линейной функцией от концентрации данной ДНК в образце. Таким образом, точно оценивать количе-ство ДНК в образце можно лишь в определённом диапазоне изначальных концен-траций ДНК, которые всё же могут обеспечить линейную зависимость. Оценка относительно изначально больших или малых концентраций ДНК образца будет неточной.
В сложных геномах эукариот, особенно млекопитающих, встречается мно-жество гомологичных генов, последовательности которых очень сходны, что накладывает дополнительные условия на дизайн зондов для микрочипов. Зонд, сконструированный для одного гена A, может также «поймать на себя» ещё и ге-ны B, C, D, оказавшиеся гомологичными гену A, что исказит итоговую картину.
Ещё одно ограничение связано с объемом базы известных генов. Невозмо-жен синтез зонда, соответствующего неизвестному гену, и никакие взаимодей-ствия таких генов не могут быть обнаружены. Эта проблема особенно актуальна для прокариот, так как геномы даже близкородственных организмов могут значи-тельно отличаться. Например, у вида бактерий Aggregatibacter actinomycetemcomitans геномы различных штаммов могут различаться на 20% ге-нов и, следовательно, микрочипы, сконструированные под один штамм, не смогут обнаружить другой.