В данной статье представлен инновационный метод диагностики активности протеаз.
Протеазы — это ферменты, отвечающие за гидролиз пептидных связей в пептидах и полипептидах, что делают их важнейшими регуляторами практически всех биологических процессах.
В ходе эволюции живых организмов протеазы прошли путь от неселективных пищеварительных ферментов до высокоорганизованных молекулярных ножниц, которые регулируют сложные сигнальные сетки живых организмов. Каталитическая активность ферментов протеаз подвержена жесткому контролю на нескольких уровнях:
• Экспрессия генов
• Транспортировка
• Созревание
• Посттрансляционные модификации
Если хоть одна часть столь тонкого процесса нарушается, то в организме сбивается ритм жизненно важных процессов. Развиваются многие заболевания, включая рак и воспалительные заболевания.
В настоящее время протеолитические функции белков значительно расширились, они стали управлять сложнейшими сигнальными последовательностями в нашем организме. Как было упомянуто, сбой в развитии каталитических свойств протеаз приводит к заболеваниям. Современное представление о роли протеаз указывает на то, что они являются отличными молекулярными мишенями для разработки ингибиторов, а также для создания химических зондов, которые помогут визуализировать избыточную активность ферментов. В настоящее время есть платформенные технологии для идентификации и оптимизации субстратов и ингибиторов протеаз, которые используются для изучения специфичности и производства соответствующих зондов и ингибиторов. В результате данных исследований человечество получило возможность использовать терапевтические препараты. Благодаря этому успеху клинический потенциал протеаз в диагностике значительно растет и развивается и до сих пор до конца не изучен.
Таким образом, в заболевших клетках присутствуют маленькие молекулы, способные блокировать химическую активность избранных протеаз.
Введение в суть проблемы
Протеазы или пептидазы, известные как протеолитические ферменты, являются белковыми катализаторами, которые в основном отвечают за гидролиз пептидных связей в пептидных и полипептидных субстратах. Путем селективного и необратимого гидролиза целевых субстратов (ограниченный протеолиз) эти ферменты контролируют подавляющее большинство физиологических процессов, таких как:
• Запрограммированная клеточная смерть.
• Клеточная пролиферация.
• Клеточная дифференциация.
• Механизм свертывания крови.
• Созревание белков.
• Фибринолиз.
• Воспалительный ответ.
• Иммунный ответ.
Стоит отметить также рециркуляцию отдельных аминокислот, которые впоследствии станут мономерами новых белков. Происходит это благодаря гидролизу различных белков и пептидов при содействии протеаз. Для поддержания гомеостаза ферментативная активность протеаз в организме строго регулируется.
Исходя из всего вышеперечисленного изучение активности отдельных видов протеаз позволит получить картину происходящих в организме процессов. Получение сведений о таких процессах даст возможность определить состояние организма, а данные виды протеаз обозначить мишенями для дальней их блокировки, в случае излишней активности.
Методы изучения специфичности протеаз
Обычно методы изучения специфичности протеаз ограничиваются использованием библиотек субстратов, содержащими только встречающиеся в природе аминокислоты. Данный метод не подходит для выявления активности протеаз, если она имеет протезы с перекрывающейся специфичностью (способность разных протеаз гидролизовать одни и те же участки субстратов). Повышение точности в определении можно осуществить за счет добавления неприродных аминокислот в библиотеку субстратов для исследования.
Рассмотрим данное расширения на примере использования 102-х неприродным аминокислот для изучения S1-S4 карманов эластазынейтрофилов человека. Авторы данного исследования назвали данный подход использованием библиотеки гибридных комбинаторных субстратов. Оптимальный субстрат более чем на три порядка показывал каталитическую эффективность, чем обычно используемые субстраты эластазы. Данная протеаза отлично подходит для рассмотрения, так как эластаза или (NE) имеет схожую с собой приблизительно на 54% протеиназу 3 или (PR3).
Создание библиотек субстратов с неприродными аминокислотами для анализа активности протеаз со схожей специфичностью
В качестве целевой протеазы была выбрана эластаза нейрофила, сериноваяпротеаза, которая высвобождается нейтрофилами во время воспаления. Считается, что ее основной задачей является разрушение ткани хозяина и уничтожение бактерий. Неконтролируемое разрушение тканей вредно, излишняя активность данной протезы приводит к развитию хронических обструтивных заболеваний легких, в число которых входит немелкоклеточный рак легких.
(NE) принадлежит к наиболее изученному семейству протеаз и обладает крайне широкой субстратной специфичностью. Данный фермент недостаточно хорошо перерабатывает субстраты на основе природных аминокислот, и не существует селективных по активности зондов для его исследования in situ или ex vivo.
Использование библиотеки гибридных комбинативных субстратов должно выявить высокоэффективные и селективные субстраты для NE, которые в последующем можно преобразовать в зонды для микроскопической визуализации активности.
Итак, цель разработать селективные субстраты и зонды на основе последовательности тетрапептидного каркаса Ala-Ala-Pro-Val, которая обычно используется для NE. Было создано три библиотеки субстратов P2, P3, P4, каждая библиотека содержала по 120 лунок, каждая из которых соответствовала профилируемой аминокислоте. Получилось по 120 лунок в каждой библиотеке. Это дало возможность исследовать каталитическую активность протеазы с максимальным охватом. Различные комбинации неприродных аминокислот были подобраны так, чтобы охватить наибольший спектр химического пространства. Различия в боковой цепи (щелочная, кислотная, нейтральная, гидрофильная, гидрофобная, маленький. Большие, объемные, разветвленные, неразветвленные) позволяли наиболее точно в теории определить что придётся по вкусу нашей протеазе.
Каждую из подбиблиотек субстратов проверяли при 50мкМ концентрации в общей смеси субстратов и 43нМ NE, а скорость гидролиза субстрата регистрировалась в виде относительных флуоресцентных единиц с тецениемвремени. По результатам эксперимента предпочтительными заместителями субстрата являлись:
P2- октагидро-1Н-индол-2-корбоновая кислота (Oic)
P3-диоксид метионина [Met(O)2], что в пять раз больше чем Gln, который являлся наиболее известной природной аминокислотой.
P4-предпочтение отдается субстратам с аминокислотой, содержащую очень объемную боковую цепь, такие как: Bpa, Nle(O-Bzl), Oic, Glu(O-Bzl).
Таким образом, NE предпочитает субстраты, содержащие объемные боковые цепи.
Отдельно стоит отметить предпочтения в позиции P1. Анализ специфичности субстратов данной библиотеки показал, что наиболее хорошо расщепляются конструкции, содержащие аминокислоты Val и Abu.
Далее, когда имеется представление о наиболее предпочтительных аминокислотах в каждом из положений, можно путем подстановки в разные места эталонной последовательности Ac-Ala-Ala-Pro-Ala-ACC. Измерение каталитической скорости подтвердило порядок селективности, предсказанный на скрининге библиотек.
Теперь производим синтез оптимального флуорогенного субстрата Ac-Nle(O-Bzl)-Met(O)2Oic-Abu-ACC, содержащий лучшую неприродную аминокислоту Abu в положении P1 (синтез происходил твердофазными методами). Анализ каталитической эффективности показал, что этот субстрат более, чем в 7000 раз лучше гидролизуется ( k cat / K m = 4,79 × 10 7 M -1 · с -1 ) под действием NE, чем обычно используемая коммерческая пептидная последовательность, основанная на Ala-Ala-, например Pro-Val (Ac-Ala-Ala-Pro-Val-ACC)
Селективность NE по сравнению с протеиназой 3
Протеиназа 3 — это наиболее связанная по своим свойствам с NEнейтрофильная протеаза (миелобластин). Она на 54% идентична и расположен а преимущественно в нейтрофилах и также как и NE отдает предпочтение Val в положении P1, следовательно любые попытки разработать зонд или субстрат для NE должны учитывать и PR3. Для оценки активности двух протеаз необходимо получить их преимущественно от одного поставщика. Очистить их от нормальных нейтрофилов человека и определить концентрацию их активного центра титрованием 3,4-дихлоризокумарином для обеспечения равной и оптимальной активности двух протеаз.
Проведение анализа с оптимальным субстратом также потребовало изменение буфера с высоким содержанием соли (0,1 М Hepes, 0,5 М NaCl при pH 7,5) на буфер с низким содержанием [50 мМ Hepes, 0,1 М NaCl, 0,1% (об./ vol) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich) при pH 7,4], потому что субстрат имеет предел растворимости 10 мкМ в водном растворе.
Результаты эксперимента:
Вывод
Использование неприродных аминокислот в библиотеках субстратов позволяют определять активность одной из нескольких протеаз, с перекрывающейся специфичностью. Использование данного механизма изучения и определения структуры субстрата также, может быть, и эффективна на других семействах протеаз. Внедрение данной технологии поможет решить вопрос с определением целевой протеазы для контроля над необходимым процессом в организме.